几种蛋白的提取

（一）小麦种子谷蛋白的提取（检测）

一粒或半粒小麦种子砸碎

加1mL 70%乙醇，振荡30min

13000rpm离心10min，弃上清

沉淀加入1 mL 55%异丙醇，振荡混匀（必要时用解剖针搅匀），65℃水浴30min

13000rpm，10min弃上清

沉淀加入1 mL 55%异丙醇，同上再重复2次（共3次）

加入100μl（根据沉淀的量，适当增减）溶液B（含1%DTT）:（ 1 mL溶液B加0.01g DTT）65℃水浴30min(间振3-4次)

加入100μl（根据沉淀的量，适当增减）溶液B（含1.4% 4-乙烯基吡啶）1mL溶液B加14μl的4-乙烯基吡啶

65℃水浴30min(间振3-4次)

13000rpm，15min，上清即为谷蛋白溶液

吸取50μl上清，再加60μl 2×loading buffer，-20℃保存

SDS-PAGE上样前样品的处理：

1、取样品，65℃水浴30m in

2、上样量：大胶：12-15μl 小胶：10μl（两侧点样孔若点loading buffer，则条带较平直）

谷蛋白提取相关试剂

1、1M Tris-HCl(pH8.0，500 mL)

称取Tris 60.57g，加350 mL Milli-Q溶解，再加浓HCl调节pH为8.0，最后定容至500mL

2、solutionB

50%异丙醇8% Tris-Hcl(1M, pH8.0)

3、2×SDS loading buffer （100 mL）

1 M Tris-HCl(pH8.0) 8mL

甘油40 mL

SDS：2g

溴酚蓝0.02 g

Milli-Q 补水至100 mL

（二）谷蛋白的提取（for HPLC）

第一步：提取蛋白（同检测提法）

第二步：蛋白沉淀

1.全蛋白：上清加入丙酮（使丙酮含量为60%，如120μl丙酮，80μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为全谷蛋白（HMW+LMW），-20℃保存

2. HMW-GS：上清加入丙酮（使丙酮含量为40%，如80μl丙酮，120μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为HMW-GS，-20℃保存

3. LMW-GS: 上清加入丙酮（使丙酮含量为40%，如80μl丙酮，120μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，取上清，加入丙酮（使丙酮含量为80%，如400μl丙酮，200μl样品（样品中还含有80μl丙酮）），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为LMW-GS，-20℃保存

第三步：洗蛋白（乙腈有毒，TFA极易挥发，操作在通风橱进行）

1. 13000rpm，10min，弃上清

a. 用1mL无水乙醇洗涤沉淀，混匀涡旋后8000rpm，5min，弃上清

b. 用500μl 0.07%巯基乙醇的丙酮溶液（7μl到10mL，现用现配）（7μl到10mL，现用现配）洗涤沉淀，混匀涡旋后10000rpm，5min，弃上清

2.室温干燥

3.加50μl溶解液（50%乙腈5mL+0.05%TFA5μl+ Milli-Q 5mL）充分混合，溶解为止

（三）种子清球蛋白的提取（for 2DE）

实验之前要提前准备研钵和液氮；预先称0.025gDTT于10mL离心管中

1.样品的研磨转移（为避免转移过程中蛋白损失太多，蛋白提取液可酌情增加）

称取小麦种子0.5g，用液氮研磨至细粉状（约20min）

将研磨放置于通风橱下，加入50μl的PMSF溶液和1mL蛋白提取液

继续研磨至液体，并将之转移到已有DTT的10mL离心管中

用1.5mL蛋白提取液分2-3次洗涤研钵，并转移到10mL离心管中

2.样品的处理（1）

样品涡旋1min 超声波处理（15次，2S, 2S）4ºC放置2h（间振3-4次）

提前30min将4ºC离心机打开

3.样品的处理（2）

4ºC ，13000rpm，15min

取上清再离心4ºC ，12000rpm，5min

取上清，加1.2倍体积Tris-平衡酚（取下层酚液）

冰浴10min

4ºC ，13000rpm，30min

取上清（千万不要取上来下层的物质），4ºC ，13000rpm，20min

取上清，加5倍体积乙酸铵/甲醇溶液，-20 ºC沉淀（至少4h）

4.样品的洗涤

取出样品，4ºC ，13000rpm，10min

沉淀用0.02g DTT/10mL丙酮悬浮（后者提前放入-20ºC预冷），4ºC ，13000rpm，10min 如此洗涤沉淀3次，并将样品分装2mL的小管

将小管放入超净工作台风干，观察到蛋白表面有裂缝时即可将之放入-20 ºC保存。

所用药品：(最好都是进口药品)

1.种子清球蛋白提取液：100mL

Tris: 0.06057g

KCL: 0.7455 g

EDTA.2Na: 0.1861 g

蔗糖：30 g,

用Milli-Q溶解，并定容为100mL

2. PMSF:0.1742g,溶解并定容至10mL, 分装0.5 mL的小管，-20 ºC保存

3.0.1M乙酸铵/甲醇溶液:0.7708g乙酸铵,用甲醇溶解并定容至100mL

4. Tris-平衡酚（现成的试剂）、丙酮、液氮、DTT

PMSF，苯甲基磺酰氯，phenylmethanesulfonyl fluoride剧毒！严重损害呼吸道粘膜、皮肤

（四）醇溶蛋白的提取（for A-PAGE）

1.种子砸碎，称取30mg，加入300μl 70%乙醇，震荡1h

2.封口，4℃冰箱过夜

3.室温，13000rpm 离心20min，

4.取上清，加入等体积A-PAGE专用loading buffer。

（五）醇溶蛋白的提取（for HPLC）（离心均在室温下进行）

0.5g种子，用液氮充分研磨，称取45mg，加入1mL Milli-Q，震荡5min

13000rpm 5min，弃上清。

沉淀加入1mL40%乙醇，用移液器搅匀，震荡45min