双光子荧光显微镜的原理特点
双光子显微镜原理
双光子显微镜原理
1 、双光子显微镜原理
双光子显微镜是一种新型的三维显微技术，它由一个复杂的光子传输仪、一个激光源和一个光学探头组成。
双光子显微镜的基本原理是利用微米级的激光束分别照射样品表面，多达几千个光子则被反射到仪器的探头，这些光子经过聚焦到固定的电子探测器上，并被计算机整合，获得了样品的三维结构信息。
双光子显微镜最大的优点在于可以实现快速、高分辨率、高空间分辨率的三维显微成像。
此外，由于光学部分的几乎完全抑制，可以大大减少在样品上的损伤。
双光子显微镜的应用可以分为两个主要方面：一是定量构象成像，在生物和材料科学等领域有着广泛的应用，可以用来获得更多的生物结构信息以及揭示细胞活性的详细机理；另一个是影像计算术，主要是利用图像分析的方法来解决复杂的问题，如双光子显微镜可以用来分析样品深度和结构，从而获得物质成分、表面形貌以及更多的三维信息。
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荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应是指当一束激光通过荧光材料时，两个光子同时被吸收并导致荧光发射的现象。
这种效应在近年来得到了越来越多的关注，因为它具有许多优点，例如更高的空间分辨率和深度穿透能力。
荧光材料是一种特殊的材料，它可以吸收一定波长范围内的电磁辐射并发出可见光。
这种现象被称为荧光效应。
在双光子效应中，两个激光光子被吸收后，电子从基态跃迁到激发态，并在退激发过程中发出荧光信号。
与传统单光子激发相比，双光子激发具有更高的局部化和深度穿透能力。
这是因为双光子效应只会在聚焦点处发生，而且其穿透深度比单光子更大。
这使得双光子显微镜成为生物医学领域中重要的成像技术之一。
除了生物医学领域外，双光子效应还可以应用于光电转换、光学存储和激光打印等领域。
此外，由于双光子效应的独特性质，它还可以用于制备具有高分子量的荧光材料。
总之，荧光材料的双光子效应是一种非常有前途的技术，在各个领域
都有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，相信这种技术将会在更多领域得到应用。
双光子显微镜工作原理
双光子显微镜工作原理
双光子显微镜的工作原理
双光子显微镜是一种新型的显微技术，它是在光学观察下观察生物样本的最新技术，它可以实现非常高的分辨率和原位观察，比传统的显微镜技术更加的灵敏和准确。
双光子显微镜的工作原理是利用双光子分子吸收谱来观察生物样品。
双光子显微镜的工作原理是借助双光子的趋向性，当双光子吸收谱以较低的功率射射入样本的时候，双光子就会释放出另外一个光子，这个光子会受到样本的影响，从而形成一个分子图像，而这个图像就是我们看到的图像。
双光子显微镜的观察深度是非常深的，可以达到纳米级别的分辨率。
此外，由于双光子吸收谱的低功率，因此样本不会受到任何损伤，这意味着可以进行原位观察。
由于双光子显微镜的优势，它已经受到了各界的广泛应用。
它主要用于细胞学、药物研究、病毒检测、微生物观察等领域。
同时，由于它可以实现非常高的分辨率，也可以用于医学影像学等领域。
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荧光显微镜的原理与应用
荧光显微镜的原理与应用前言荧光显微镜是一种利用荧光现象进行观察和显示样品细胞或分子结构的显微镜。
它的原理和应用使得生物学、医学、材料科学等领域的研究变得更加准确和深入。
本文将介绍荧光显微镜的原理、构成和其在不同领域的应用。
一、荧光显微镜的原理荧光显微镜的成像原理基于光的荧光现象和酵素固有荧光物质本身的特性。
1.光的荧光现象当物质受到一定波长的光照射后，能量被吸收并再次散发出去。
荧光显微镜利用激发光的波长激发标记在样品中的荧光物质，使其发出荧光信号。
这种荧光信号可以被荧光显微镜所捕获和放大，进而产生图像。
2.酵素固有荧光某些分子具有自身固有的荧光性质。
这些分子可以从基态跃迁到激发态，并在激发态上持续存在一段时间后再跃迁回基态。
通过观察这些分子的荧光信号，可以获得关于样品的信息。
二、荧光显微镜的构成荧光显微镜通常由以下几个主要部件组成：1.光源：用来提供激发样品的激发光，常用的光源有氘灯、汞灯、激光器等。
2.激发光滤镜：用于选择性地过滤或选择激发光的特定波长。
3.物镜：用来放大样品并收集由荧光物质发出的荧光信号。
4.荧光筛选器：用来选择特定的荧光波长，并阻挡其他波长的光线。
5.观察系统：包括目镜、眼镜或摄像机等设备，用于观察和记录荧光信号。
三、荧光显微镜在不同领域的应用荧光显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
1.生物学研究荧光显微镜可以帮助研究者观察和分析生物学样本中的细胞结构和功能。
通过将特定荧光染料标记到细胞中，可以实时监测细胞的代谢状态、基因表达和蛋白质定位。
2.医学诊断荧光显微镜在医学诊断中发挥着重要作用。
例如，通过使用荧光标记剂可以检测肿瘤细胞，帮助医生进行早期诊断和治疗。
3.材料科学荧光显微镜在材料科学中的应用主要集中在材料的结构和性能测试上。
通过标记某些特定的分子或颗粒物，并观察它们在材料中的分布和运动，可以更好地了解材料的组成和特性。
4.环境监测荧光显微镜也可以应用于环境监测领域。
双光子显微镜技术作者细胞生物组刘洋完整请见双光子
双光子显微镜技术作者：细胞生物组刘洋完整ppt请见附件双光子显微镜问世于上世纪90年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。
目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。
本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。
一、双光子显微镜发明的背景光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。
在传统宽场（Widefield microscope, WF）光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上（视网膜或感光元件在此），导致被接收的光线90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。
对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。
为了消除杂散光的干扰，Malvin Minsky于1957年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, confocal）。
与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。
通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD或CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。
为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行X-Y方向扫描，来自扫描区域内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。
由于有效滤除了杂散光，激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向200nm，纵向400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞CT”），解决了标本内部细节的问题。
在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ模式）、动态图（XYt模式）或光谱图（XYλ）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。
荧光显微镜的原理和使用方法课件
目录
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的原理 • 荧光显微镜的使用方法 • 荧光显微镜的维护与保养 • 荧光显微镜的应用实例
01
荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，随着光学和化 学的发展，荧光显微镜开 始出现。
荧光显微镜的发展
荧光灯泡表面不可直接触摸，清洁时 应使用软布或手套。
清洁载物台
用干燥的软布擦拭载物台，避免污渍 和划痕。
荧光灯泡的更换与保养
更换荧光灯泡
当荧光灯泡亮度降低或出现闪烁时，应更换荧光灯泡。更换时应关闭电源，并按照说明书正确操作。
保养荧光灯泡
荧光灯泡应在低电流下使用，避免频繁开关灯，以延长使用寿命。
常见故障排除与维修
20世纪初，荧光显微镜技 术逐渐成熟，并广泛应用 于生物学、医学等领域。
荧光显微镜的改进
随着科技的进步，现代荧 光显微镜在分辨率、成像 质量、自动化等方面不断 得到提升。
荧光显微镜的基本组成
光源
发出特定波长的光，激 发样品中的荧光物质。
滤色片
选择性地透过特定波长 的光，阻挡其他波长的
光。
物镜
将样品中的荧光图像放 大，并传递给目镜或摄
电源故障
检查电源插头是否松动，电源线 是否破损。如有问题，应更换电
源线或修理电源插座。
图像模糊
可能是镜头污染或载物台移动造成 的。应清洁镜头和载物台，确保其 表面干净无痕。
荧光灯泡不亮
可能是灯泡损坏或电路故障。应检 查灯泡是否正常，如有问题应更换 ；同时检查电路是否正常，如有故 障应及时维修。
05
荧光显微镜的调试
双光子荧光显微镜的研究
浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。
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篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。
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２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。
通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。
本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。
§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。
其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。
图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。
由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。
由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
双光子显微镜
双光子显微镜/view/1428311.htm?fr=ala0_1双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。
这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。
在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象。
因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。
光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。
在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜的原理和结构特点：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。
它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜就其光路来分有两种：
1．透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。
常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。
其优点是低倍镜时荧光强，而缺。
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数LSM780双光子激光共聚焦显微镜是一种基于双光子荧光共聚焦显微镜技术的高性能显微镜，具有高分辨率、深入组织的成像能力，能够提供关于三维结构和功能的细胞和组织的详细信息。
下面将详细介绍LSM780双光子激光共聚焦显微镜的技术参数。
1. 激光系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常配备两个紫外激光器，能够提供两个不同波长的激光，通常为800nm和1040nm。
这些激光器可以分别或同时使用，以适应不同的样品和实验需求。
2.激光功率：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的激光功率通常在几十至上百毫瓦之间。
激光功率的选择取决于样品的特性和实验需求，功率越高，进一步成像的深度越大，但也会增加样品的破坏风险。
3.探测系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的探测系统包括一个探测单元、一个光学滤光片轮和一个光电倍增管（PMT）。
探测单元通常包含两个探测器，可用于收集荧光信号和二次非线性光学信号，以获得不同的成像信息。
4.透射探测：LSM780双光子激光共聚焦显微镜还可配备透射探测系统，用于监测透过样品的激光强度，以实现更精确的深度控制和真实的三维成像。
5.XY扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的扫描系统通过使用高速扫描镜和电子扫描控制器来实现XY扫描，以获取二维图像。
扫描速度和分辨率可以通过调整激光功率和扫描模式进行优化。
6.Z轴扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的Z轴扫描系统通常由一个压电陶瓷驱动器和一个扫描镜组成，可以实现在样品的Z轴方向上进行成像，从而获得三维图像。
7. 图像处理软件：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常使用配套的图像处理软件，如Zeiss ZEN软件，用于图像采集、分析和处理。
该软件提供了多种功能，包括多通道成像、3D成像和图像重建等。
总之，LSM780双光子激光共聚焦显微镜具有先进的激光系统、灵活的样品探测系统、高速和高精度的扫描系统以及强大的图像处理软件等技术参数，为研究者提供了一种高分辨率、高亮度和无损伤成像的显微技术工具。
医学研究中的双光子成像技术应用
医学研究中的双光子成像技术应用随着现代医学技术的不断进步，人类已经能够对疾病进行更精确的诊断和治疗。
其中，双光子成像技术是一种非常先进的诊断技术，它可以用来观察细胞内的分子过程，包括DNA复制、蛋白质合成等等。
今天，我们就来探讨一下双光子成像技术在医学研究中的应用。
一、双光子成像技术的基本原理双光子成像技术是一种光学成像技术，它利用两个低能量的光子激发样本体内的荧光分子，通过探测这些荧光信号来获得样本的影像。
与传统的激光荧光显微镜相比，双光子成像技术具有更高的空间分辨率和更深的成像深度。
二、双光子成像技术在肿瘤学中的应用肿瘤学是医学研究的重要领域之一，而双光子成像技术在该领域的应用也越来越广泛。
例如，该技术可以用于研究肿瘤细胞的转移和扩散过程，以及评估肿瘤治疗的效果。
近年来，研究人员通过双光子成像技术发现了一些新的抗肿瘤药物和治疗方案，这为肿瘤治疗提供了更多的选择。
三、双光子成像技术在神经科学中的应用神经科学是医学研究中的又一重要领域，而双光子成像技术在该领域的应用同样十分广泛。
例如，该技术可用于观察神经元的动态分布和运动，以及评估神经可塑性和脑功能的改变。
此外，双光子成像技术还可以用于研究神经元之间的相互作用和信号传输机制。
四、双光子成像技术在心血管医学中的应用心血管疾病是现代社会中常见的疾病之一，而双光子成像技术在该领域的应用也越来越受到重视。
例如，该技术可以用于观察血管内皮细胞的生理和病理变化，以及评估心血管药物的效果。
此外，双光子成像技术还可以用于研究心血管系统的微循环和代谢机制。
五、双光子成像技术的未来展望双光子成像技术的应用领域越来越广泛，预计未来还有更多的应用发展。
例如，该技术可以用于观察病毒入侵细胞的过程，以及研究生物细胞的自组装和微纳米结构。
除此之外，双光子成像技术还可以用于环境污染监测、食品安全检验等领域。
总之，双光子成像技术在医学研究中的应用前景十分广阔。
未来，随着该技术研究的深入和进一步改进，相信将会有更多的应用领域被开发出来。
双光子显微镜技术
双光子显微镜技术作者：细胞生物组刘洋完整ppt请见附件双光子显微镜问世于上世纪90年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。
目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。
本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。
一、双光子显微镜发明的背景光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。
在传统宽场（Widefield microscope, WF）光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上（视网膜或感光元件在此），导致被接收的光线90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。
对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。
为了消除杂散光的干扰，Malvin Minsky于1957年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, confocal）。
与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。
通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD或CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。
为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行X-Y方向扫描，来自扫描区域内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。
由于有效滤除了杂散光，激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向200nm，纵向400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞CT”），解决了标本内部细节的问题。
在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ模式）、动态图（XYt模式）或光谱图（XYλ）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。
双光子共焦显微镜的工作原理
双光子共焦显微镜的工作原理双光子共焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscope, 2P-CM）是一种高分辨率的显微镜技术，通过使用非线性光学效应来实现对生物样品的成像。
与传统的单光子荧光显微镜相比，双光子共焦显微镜具有更好的光深穿透能力和较低的光损伤性，因此被广泛应用于生命科学研究领域。
1. 双光子共焦显微镜的基本原理1.1 光的双光子吸收双光子共焦显微镜利用注入样品的高能量激光束，通过非线性吸收效应实现成像。
在常规显微镜中，荧光分子被激发到高能级，然后辐射出较低能级的光子。
而双光子共焦显微镜中，两个低能量光子同时作用于样品的一个分子上，通过吸收两个光子的能量，荧光分子才会被激发。
这种吸收方式只发生在激光束的焦点附近。
1.2 双光子激发荧光在双光子共焦显微镜中，激发的荧光只发生在光束焦点的非线性光学效应区域内。
由于双光子激发荧光只发生在焦点处，因此可以避免样品其他区域的荧光信号干扰。
这样，双光子共焦显微镜可以实现更好的光深穿透能力，同时减少了样品的光损伤。
2. 双光子共焦显微镜的工作步骤2.1 激光光源双光子共焦显微镜使用超快激光作为光源。
这些激光器产生具有较高光能量和较窄脉冲宽度的激光束。
常用的激光器包括钛宝石激光器和光纤激光器。
2.2 光路系统双光子共焦显微镜的光路系统主要包括准直系统、物镜、光学滤波器和探测器。
准直系统通过聚焦激光束，将其聚焦到样品的焦点位置。
物镜收集经过样品的荧光信号，并将其聚焦到探测器上。
光学滤波器用于选择特定的波长范围，以增强成像质量。
2.3 数据采集和成像双光子共焦显微镜通过扫描激光束和收集荧光信号来获取图像。
通常，激光束在样品上进行快速扫描，而探测器记录下相应的荧光信号。
通过逐点记录和成像，可以获得三维样品信息。
3. 双光子共焦显微镜的应用3.1 三维成像双光子共焦显微镜具有较好的光深穿透能力，在生命科学研究中被广泛用于三维细胞和组织成像。
基于双光子成像技术的细胞生物学研究
基于双光子成像技术的细胞生物学研究随着科技的快速发展，生物学领域的研究也变得更加深入和高效。
其中，双光子成像技术是一种新兴且颇为先进的技术，已经成为细胞生物学研究领域的热点之一。
双光子成像技术是一种非侵入性、高分辨率的显微成像技术。
它可以在细胞或者组织的内部进行图像成像，而不会影响细胞或组织的生理状态。
其原理是利用两束波长不同、能量相互对应的激光束同时照射待观察的细胞或组织中的荧光染料，从而激发染料分子的荧光，利用高灵敏的探测器收集荧光信号，并进行成像。
相比传统显微镜技术，双光子成像技术可以提供更大的进深度、更高的分辨率和更好的成像质量，为生物学领域研究提供了更多的可能性。
在细胞生物学研究中，双光子成像技术的应用越来越广泛。
例如，它可以被用来观察细胞内分子的运动轨迹、活跃程度和局部浓度等信息。
研究人员可以通过染色体标记的方法，定位到特定的细胞亚结构并对其进行跟踪和分析。
此外，双光子成像技术还可以用来探究细胞膜的动态变化，帮助研究人员更好地理解细胞的膜生物学过程，如囊泡运输、内流等。
还有一个重要的应用领域是细胞的免疫学研究。
通过双光子成像技术，研究人员可以非常精确地定位到免疫细胞，发现它们在攻击病原体时的运动方式和驱动方式。
此外，该技术还可以用于研究T细胞和巨噬细胞的触碰和聚集机制，从而深入探究免疫细胞的行为规律和内部机制。
除了在生物学领域的研究中，双光子成像技术也被广泛运用于医学领域。
例如，在神经科学领域，该技术可以被用于研究神经元的变化和传递过程，从而深入探究神经系统的复杂机理和异常现象。
此外，该技术还可以用于肿瘤诊断和治疗方面的研究，例如通过显像技术检测肿瘤分子标记和血管新生等。
总之，双光子成像技术已经成为细胞生物学研究领域的一种重要工具，对于生物学研究的发展和突破有着非常重要的作用。
未来，随着该技术的不断发展和创新，我们相信会有更多的重大科学成果被取得，从而深入了解生物体内复杂机理和生物进化本质。
双光子荧光
双光子共焦激光扫描荧光显微镜的应用
application
钙离子通道的观察--贝尔 实验室研究了活体大脑皮 层神经元细胞内的钙离子 动力学情形. 对活老鼠大 脑作标记后,拨弄老鼠的 胡须以产生刺激,观察到 发生在大脑细胞神经元间 突触的活动,成像深度可 深达大脑240μm。
三维高密度存储及微 细加工--由于双光子激 发具有有效作用体积 小的特点,避免了层与 层间的相互干扰,极大 地提高了数据存储密 度.
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3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)； (2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是 一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
一成功用于双光子显微镜的双光子探针。
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双光子荧光探针的研究领域
双光子葡萄糖示踪器
具有良好的光稳定性，能够持 续监控正常细胞与结肠癌细胞摄入葡萄糖的过程，能够成 像观察癌细胞与结肠癌深处抗癌剂的能力，为癌症的早期 诊断提供帮助 双光子巯基探针 根据探针与巯基反应后荧光增强， 可用双光子显微镜探测活体细胞与组织90-180μ m深处的 巯基成像情况 双光子半胱氨酸探针 根据醛基（sp2）与半胱氨酸 反应后转变为叔甲基(sp3)而丧失吸电子效应这一原理实现
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
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光片荧光显微镜特点及其应用
光片荧光显微镜特点及其应用一、引言1.1 光片荧光显微镜简介1.2 本文目的二、光片荧光显微镜的特点2.1 高分辨率2.2 高灵敏度2.3 多通道成像2.4 非侵入性观察三、光片荧光显微镜的工作原理3.1 光的激发3.2 光的收集和分光3.3 荧光信号的捕捉和检测3.4 图像处理和分析四、光片荧光显微镜的应用4.1 生命科学领域4.2 材料科学领域4.3 医学诊断领域4.4 环境监测领域五、未来发展趋势5.1 双光子激发荧光显微镜5.2 显微镜与人工智能结合5.3 多模态成像技术结论【正文】一、引言1.1 光片荧光显微镜简介光片荧光显微镜是一种基于光学原理来观察物质表面的显微镜。
相较于传统的光学显微镜，光片荧光显微镜利用荧光标记技术，使物质在特定波长的光激发下发出荧光信号，借助高灵敏度的检测系统采集信号，并通过图像处理和分析展示样品的细节结构。
光片荧光显微镜广泛应用于生命科学、材料科学和医学诊断等领域。
1.2 本文目的本文旨在全面、详细、完整地探讨光片荧光显微镜的特点及其应用。
首先，介绍光片荧光显微镜的特点，包括高分辨率、高灵敏度、多通道成像和非侵入性观察等。
然后，详细解析光片荧光显微镜的工作原理，包括光的激发、光的收集和分光、荧光信号的捕捉和检测，以及图像处理和分析。
接着，列举光片荧光显微镜在生命科学、材料科学、医学诊断和环境监测等领域的应用实例。
最后，探讨光片荧光显微镜的未来发展趋势，包括双光子激发荧光显微镜、显微镜与人工智能的结合以及多模态成像技术的发展。
二、光片荧光显微镜的特点2.1 高分辨率光片荧光显微镜具有较高的分辨率，可以观察到细胞和微观结构的细节。
荧光标记技术使细胞和组织中的特定分子或结构发出荧光信号，并通过显微镜的高分辨率系统清晰显示。
因此，光片荧光显微镜广泛应用于生命科学研究中，例如细胞生物学和神经科学等领域。
2.2 高灵敏度光片荧光显微镜具有高灵敏度的检测系统，可以捕捉到微弱的荧光信号。
双光子荧光显微镜的原理特点
双光子荧光显微镜的原理特点
1.双光子激发
双光子荧光显微镜的激发方式与传统的荧光显微镜不同。
传统的荧光显微镜利用一束高能光子激发荧光标记物，而双光子荧光显微镜则采用两束较低能量的激光束同时照射样本，仅在聚焦点处产生足够高的能量密度来激发荧光。
2.非线性激发
3.深层成像
4.较小的损伤风险
5.三维成像能力
6.高分辨率
总之，双光子荧光显微镜通过采用双光子激发和非线性光学特性，实现了高分辨率、深层、三维成像，并具有较小的损伤风险等优点。
它在生命科学研究中发挥着重要的作用，为科学家们提供了窥探细胞和组织内部结构与功能的新窗口。
双光子显微镜的独特优势
相关技术指标与进口必要性双光子显微镜的独特优势有以下几点：1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。
对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。
2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。
更加适合活体下微弱荧光信号的观察。
3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。
4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。
利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。
在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。
利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。
主要技术指标：1 显微镜1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm；1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式对样品进行定位和观察；1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm；1.4 配备长寿命落射荧光光源；1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块；1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直接近样品表面；1.7 配有放大倍率为4倍, NA≥0.2, WD≥20mm的物镜。
荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点
荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点发布时间:2011-06-14荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点荧光显微镜的原理是什么,荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是医学检验中的重要仪器之一。
在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。
它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
两种滤光片必须选择配合使用。
萤光显微镜原理:(1) 光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。
(2) 激励滤光源:透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。
(3) 荧光标本:一般用萤光色素染色。
(4) 阻挡滤光镜:阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。
以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。
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双光子荧光显微镜的原理特点
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
双光子激发的基本原理是：
在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。
这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。
在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。
1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限:
1)一是光毒性现象：
因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得
足够的信噪比;
而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。
2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。
在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。
2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器?
双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。
例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。
长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。
这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。
3.双光子显微镜的激光器有何特别之处?
双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。
双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。
因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。
主要的是在一个很小的范围提供非常高密度的光子，可以保证双光子的同时激发。
4.双光子激发的优点是什么?
1)增加了染料的选择性：共聚焦系统的激光器(Ar,Ar/Kr,HeNe)的激发光范围在488nm-647nm
这就意味着想用紫外激发荧光染料的实验进行，例如使用DAPI,Hoescht
而双光子的激发波长是单光子的两倍，所以紫外激发的染料能被近红外光激发。
2)减少光漂白：因为光漂白减少的减少使得用CFP/YFP做荧光共振能量转移(FRET)的实验的成功率提高。
3)无需特殊的物镜：从硬件的角度出发，用近红外光的波长激发紫外激发染料不需要特殊的紫外光学组件。
4)提高信噪比：激发光波长和发射光波长具有很大的差别，提高了信噪比。
5)漂白局限于焦点处：
因为荧光激发只发生在物镜的焦点上，所以就不需要共聚焦针孔了。
这样提高了光的检测，而且光漂白只发生在焦点上。
6)更容易穿透标本：红外波长的光不易被细胞散射，能穿透更深的标本。
5.相对于激光扫描共聚焦显微镜，双光子显微镜做的改进是什么?
1)减少了光漂白。
2)减少了光毒性。