2011.3.3原生质体制备和转化
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化是一种生物技术，旨在将外源DNA引入宿主细胞以获得特定的遗传性状态或表观遗传变化。
原生质体转化原理是一种利用外源DNA（例如体外克隆的DNA和质粒）彻底改变宿主细胞的生理特性。
它为研究者提供了一种简便的方法来改变宿主细胞的遗传特性，同时也能够可靠地测定插入外源DNA的效果。
原生质体转化可以用于实验检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化是一种简易的、可重复的、可控的、有效的技术，可以用来利用外源DNA改变宿主细胞的生理表型，插入和表达外源DNA成为宿主细胞的一部分。
原生质体转化可以被用来驱动各类基因的表达，修改受体的结构，调控蛋白质表达。
原生质体转化是一种可以用来将外源DNA进行插入的非常有效的技术，其优势在于很多具有特定功能的DNA可以被插入宿主细胞，可以较快的检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化依赖于抗生素耐受性，以及抗性转录因子的表达。
这种抗生素耐受机制通过一系列复杂的交互作用使宿主细胞能够耐
受特定的抗生素，该抗生素是质粒DNA的载体，从而达到对特定DNA 序列的特异性。
另外，原生质体转化还可以依赖于转录抑制因子的表达，如亢余的转录抑制因子，以防止宿主细胞的表达被抑制，并保持外源DNA的表达稳定。
总而言之，原生质体转化是一种简便而可靠的技术，可以用来改变宿主细胞的遗传特性，实现对基因功能的检测，以及研究调控机制的功能。
生物药物综合实验----植物原生质体的制备
实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
原生质体制备的方法
原生质体制备的方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠原生质体制备的那些事儿。
你想想看啊，原生质体就像是一个小小的神秘世界，等着我们去探索和解锁呢！要制备它呀，就好像是一场精心策划的冒险。
咱先得选好材料，这就好比是要踏上征途得先选好一匹好马呀！不同的材料就像是不同性格的马，各有各的特点和脾气。
选对了，后面的路就好走多啦。
然后呢，就是处理环节啦。
这可得小心翼翼的，就跟雕刻一件艺术品似的，不能太用力也不能太轻了。
得掌握好那个度，不然可就前功尽弃喽！你说要是不小心给弄砸了，那得多懊恼呀！接着就是酶解啦。
这酶就像是一把神奇的钥匙，能打开原生质体这个神秘世界的大门。
可要选对酶哦，不然门打不开，咱不就白忙活啦！在这个过程中，时间和温度都很关键呢，就好像煮汤一样，火候得把握好。
等酶解完了，就得过滤啦。
这就好像是把沙子和金子分开，要把我们想要的原生质体给筛选出来。
这一步也不能马虎呀，得仔仔细细的。
然后呢，就是洗涤啦。
把那些杂质都洗掉，让原生质体干干净净的。
这就像是给宝贝洗澡一样，得温柔点，可别把它弄疼了。
最后呀，就是培养啦。
给原生质体创造一个舒适的环境，让它能好好地生长发育。
这就像是给小树苗找了个好地方种下去，得精心呵护着。
哎呀呀，制备原生质体可不是一件容易的事儿呀，但只要咱一步一步认真去做，就一定能成功！你说是不是？这过程虽然有点麻烦，但当你看到那一个个可爱的原生质体的时候，你就会觉得一切都值得啦！就像你辛苦种的花终于开了一样，那种喜悦呀，真的是没法形容！所以呀，别害怕困难，大胆去尝试吧！让我们一起在原生质体制备的世界里畅游，去发现更多的惊喜和奥秘！。
红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统
收稿日期 ! 修回日期 ! ! & & $ & ’ ! %" ! & & $ & ( ! $ 作者简介 ! 周礼红 ! $ 女$ 贵州人 $ 江南大学在读博士 $ 研究方向 # 真菌分子生物学 &+ # ) * " ’%" , . / 0 0 1 2 1 3 4 # #"5 . 1 3 3 6 7 3 -6 7 8 通讯作者 ! 诸葛 ! 健 &9 # # : 0 % ( , ’ ) & , ’ % % ( ( $ !’ + , . / 0 / . 8 2 1 4 3 = . / 0 6 7 3 : "1 ; <
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原生质体转化法
原生质体转化法原生质体转化法是以原生质体为受体的转基因方法的总称。
该方法包含两个重要的部分：原生质体的分离与再生和外源DNA 转化。
根据外源DNA 转化方法的不同可分为PEG介导转化法、电击法、脂质体介导转化法、显微注射法和农杆菌介导法等原生质体转化法。
原生质体的分离是原生质体转化法的核心步骤。
历史上原生质体的分离经历了以下三个重要阶段：（1）1892年，Klercker采用机械法进行了植物原生质体的分离。
（2）1960 年，Cocking 使用疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁，获得大量有活力的裸细胞（原生质体）。
（3）1968年，Takebe首次使用商品酶（离析酶和纤维素酶）消化掉了烟草叶肉细胞细胞壁，释放出原生质体。
自此，植物原生质体变成了一个热门的研究领域。
原生质体作为转化受体具有以下优点：（1）无细胞壁的原生质体的细胞全能性较普通细胞更好。
（2）原生质体是单细胞系统，没有或较少受周围细胞和微环境的影响。
（3）原生质体再生的植株也是由单细胞发育而来，性状易纯化且遗传稳定。
所以向原生质体导入外源基因比向其他外植体导入外源基因有更大的优势，成为遗传转化中一种良好的受体。
由于基因枪技术的不断发展，向植物体直接导入外源基因已不再像以前那么困难，所以原生质体转化法的应用日趋减少，但在特定条件下，如转移细胞器及DNA 大片段时仍有一定的应用价值。
一、基本原理植物细胞壁由中胶层（主要成分果胶质）、初生壁（主要成分纤维素和半纤维素）和次生壁（主要成分纤维素，一般也含有木质素）三部分组成，利用果胶酶和纤维素酶消化植物细胞壁，释放出原生质体。
以原生质体为转基因受体，采用转基因方法，如PEG介导转化法通过改变质膜透性，促进外源DNA 进入已分离的植物原生质体，然后经过转化原生质体组织培养获得转化植株。
二、转化方法主要包括植物原生质体的分离和外源基因转化两个重要部分。
地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究
ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ３０３ Ｗａｓ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，ｐｒｅｌｉｍｉａｒｉａｒｉｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ，．珑捃３０３，ａｎｄ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
关键词：地衣芽孢杆菌，原生质体，制备，再生，转化
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｉｔｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｊｔｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｆｏｏｄ，ｆｅｅｄ，ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．们１ｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｃａｎ ｎｏｔ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｅｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉＳ ｎｅｅｄｅｄ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｌｉｅｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ丑 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｅｍｉｓｅ ａｎｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｈｏｓｔ，
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ．ｉｔ’Ｓ ｎｅｅｄ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｉｔｓ
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
里氏木霉原生质体的制备及转化
里氏木霉原生质体的制备及转化摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化至里氏木酶原生质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子。
并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好。
关键词里氏木酶原生质制备转化前言纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，但目前只有一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等方面。
木霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全面，分解天然纤维素活力最高的一类菌。
在育种方面利用高能电子、紫外线、亚硝基胍处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高。
本试验对里氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源里氏木霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳大学生命科学学院S402实验室刘刚老师提供。
1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2⋅2H2O 4 g，MgSO4⋅7H2O 3 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制FeSO4⋅7H2O 5 g，ZnSO4⋅7H2O 1.7 g，CoCl2⋅6H2O 23.7 g，MnSO4⋅H2O 1.6 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L1.1.2.4 60％的PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容至100 ml1.1.2.5 STC山梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容至1L1.1.2.6 PDA培养基去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容至1L其中20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
高粱原生质体的制备及转化方法研究
高粱原生质体的制备及转化方法研究谢鑫; 蒋君梅; 王勇; 任明见【期刊名称】《《种子》》【年(卷),期】2019(038)008【总页数】4页(P43-46)【关键词】高粱; 原生质体制备; 转化方法【作者】谢鑫; 蒋君梅; 王勇; 任明见【作者单位】贵州大学农学院贵阳 550025; 国家小麦改良中心贵州分中心贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】Q94-336; S514近年来对高粱的研究主要集中在采用基因工程手段培育抗病、抗寒、抗逆的高粱品种等方面[3-5]。
但是，由于高粱转化及再生体系技术还不成熟，制约了利用转基因技术研究高粱基因功能，而利用原生质体可以对植物基因功能进行快速验证，因而，对高粱原生质体制备与转化研究具有重要意义。
20世纪60年代，Cocking 等第一次从藻类分离出原生质体以来，陆续从小麦、玉米、水稻、大麦等禾本科植物及木本植物中成功分离出原生质体[6-8]，原生质体的应用也扩展到基因瞬时表达、蛋白亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、启动子分析以及种质资源改良等领域。
目前，有报道用高粱悬浮细胞制备原生质体的方法[9]，但是该方法费时、费力，不利于快速验证基因功能的需要。
本研究采用高粱黄化苗进行原生质制备，转化过程只需要2 d时间，简单、快速。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试植物材料供试的高粱样品为BTx 623，来自中国农业科学院生物技术研究所。
1.1.2 供试试剂纤维素酶Cellulose R 10 和果胶酶Macerozyme R 10购自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露糖、聚乙二醇4000、氯化钙、EDTA、氯化铯、MES、KCl等购自Sigma公司；甘油、正丁醇、异丙醇、醋酸钾、SDS、氯化钠、氢氧化钠等为国产试剂。
1.1.3 实验设备主要仪器：超速冷冻离心机(BECKMAN，L100-XP)、台式离心机(EPPENDORF，5424-R)、激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，FV-1000)、普通光学显微镜(OLYMPUS)、光照培养箱、摇床和真空泵(WELCH，Model 2522 c-02)等。
原生质体技术
备注
• 1. 原生质体制备过程中，必须有渗透压 稳定剂保护，避免原生质体破裂 • 2. 所有试剂，容器，培养基必须严格灭 菌，酶液用0.6M甘露醇溶液配制，再用 微孔滤膜过滤除菌。 • 3. 严格无菌操作，避免杂菌污染
本周实验
• 实验的前期准备----菌丝培养 • （原生质体制备和DNA提取）
1. 制备培养基
2.1.5 酶解时间
• 酶解时间以2-4小时左右 • 酶解时间一般因菌种类别而异 • 时间短，形成率低
2.1.6 酶解的pH
• 多以自然为宜，pH5-6左右。
2.2 原生质体制备方法
• • • • • 菌丝活化 菌丝液体培养 酶解 原生质体分离 原生质体纯与镜检
2.2.1 菌丝活化
• 菌丝接种于PDA培养基上 • 25℃培养7-10天
大型真菌原生质体的制备
1. 原生质体技术的应用
• • • • 原生质体融合 原生质体单核化 转化（transformation） 生物化学研究
1.1 原生质体融合
• 主要问题 • 遗传不稳定 • 子实体体难形成 • 优良性状难以表现
1.2 原生质体单核化
• （获得单核体，能较好地保持亲本菌株 遗传特性） • 双孢蘑菇 • 无性生殖菌株 • 难以形成子实体的野生菌株
2.1.2 酶
• 溶壁酶（Lywallzyme） • 广东微生物研究所 • Novozyme234 丹麦 • 均为木霉产生的酶系。
2.1.3 渗透压稳定剂
• 无机盐类：NaCl、KCl、MgSO4等 • 有机糖类：甘露醇、蔗糖、肌醇 • 使用浓度：0.4～0.6mol/L
2.1.4 酶解温度
• 酶解作用的适宜温度：以30℃为宜 • 对于各种真菌来说，酶解作用的适宜温 度一般高于菌丝的适宜生长温度 • 温度偏高时，原生质体极易破裂，形成 率下降，原生质体也易产生变形，活力 下降，甚至破裂，形成率低。 • 温度偏低时，原生质体形成慢
原生质体制备与融合
Thanks!
• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会 因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重 要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的 山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法： 短时间强电场作用， 质膜发生可逆性电击 穿，促使原生质体融 合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法： 让原生质体先紧密 贴在一起，后用激 光对接触处照射， 使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁 不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低 。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则 是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随 酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
融合子的筛选
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
201133原生质体制备和转化
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4· 2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4· 12H2O（约60mL）混合至pH为6.0
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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45μm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃
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王金良学长： 1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层 擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养 23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100μL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐：
挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
植物根的原生质体制备方法
植物根的原生质体制备方法说实话植物根的原生质体制备方法这事，我一开始也是瞎摸索。
我就知道原生质体在很多研究里都特别重要，像是做些植物生理啊，基因工程方面的研究，就得有原生质体。
我试过好多方法呢。
最开始啊，我就按照一些书上说的大概步骤去做。
首先就是取材，你想啊，这植物根就像房子的地基一样重要，根基嘛，所以选材得特别小心。
我就去地里挖一些健康的植物，把根洗得干干净净的，就像给要上菜的菜洗干净泥土那样仔细。
然后就是酶解这个过程。
这个可费了我好大劲。
我就把那些处理好的根切成一小段一小段的，放进配置好的酶液里。
那酶液的配置就像是调化学药剂一样，要特别小心各种成分的量。
我一开始总是搞不对那些酶的比例，有时候纤维素酶加多了，有时候果胶酶又少了，就像做蛋糕的时候面粉和糖的比例没弄对，结果就做不出好蛋糕，我的原生质体也制备不好。
有一次我都准备放弃了，因为我觉得按照那些资料做怎么就不行呢。
后来我就想是不是我的处理环境不对。
植物细胞也是很娇贵的，就像小孩子对环境敏感一样。
我就在酶解的时候，严格控制温度和酸碱度。
温度呢就像我们人感觉舒适的温度一样，不能太热也不能太冷，酸碱度也要刚刚好。
还有一个小细节我差点忘了说。
在酶解的过程中，你得时不时轻轻搅拌一下，就像煮东西的时候偶尔搅拌一下防止粘锅。
但是又不能太用力，太用力那细胞不是就被搅拌坏了么。
这个搅拌的力度啊，我也是摸了好久才找到感觉，就像是握住一个很软弱的东西，只能轻轻晃动那种。
我不敢说我现在的方法就是最完美的。
但是经过这么多的尝试，我觉得选材要精心，酶液的配制要精确，处理环境要严谨，这些都是很重要的环节。
要是有朋友也在做这个植物根的原生质体制备，希望我的这些经验能有点帮助。
我还在继续探索呢，说不定以后发现更好的办法了，咱们还可以再交流交流。
就拿我上次用了一种新植物材料的时候来说吧。
我以为很简单，就按照之前成功的步骤来。
结果因为那个植物根的结构很特别，细胞壁特别厚，之前的酶解时间就不够了。
细胞原生质体的制备
细胞原生质体的制备—植物原生质体分离和活性鉴定一、实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程二、实验原理去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。
较早利用机械法制备原生质体的酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
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菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。
高渗再生培养基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O（约60mL）混合至pH为6.0
酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次， 用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液15002000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含 有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存 液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。
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将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min； 弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为 5×106 ~ 5×107个细胞/mL； 将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上 轻轻混匀； 加入25µL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。 将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所 长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体 涂布平板作为阴性对照。
*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L
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*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液 *高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏 斗抽滤除菌
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菌丝体培养60 h,用1. 5%溶菌酶+ 0. 5%蜗牛酶混合酶液, pH值 6. 0～6. 5,温度30～35 ℃,酶解4 h,以0. 7mol/L甘露醇为稳渗剂, 此条件下原生质体产量可达1. 68 ×107 个/ml。 PDA再生培养基, 稳渗剂为0. 5 mol/L蔗糖,双层固体培养,此条 件下原生质体再生率可达6. 05% ～6. 12%
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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45µm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃
PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)
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原生质体制备
培养时间 酶种类和浓度 酶解时间 酶解温度 渗透压稳定剂 22h 单一蜗牛酶，3% 2.5h 36℃ 无机盐溶液有利于 原生质体的释放，而糖 醇类不利于原生质体释 放（NaCl）
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基
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取培养20h的康氏木霉菌丝体悬液10mL，4000r/min离心30min 收集菌丝体，用无菌水4000r/min离心30min洗涤2次，加2.0%蜗 牛酶溶液30℃水浴酶解至原生质体形成率接近100%时停止酶解， 用0.6mol/L NaCl 5min条件下离心洗涤2次，最后将原生质体悬 于0.6mol/L NaCl溶液中。 在原生质体制备过程中每隔一定时间取酶解液制成水封片于显 微镜下观察。
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《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚 *菌丝培养基： 1、葡萄糖蛋白胨培养基 2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐 用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数 ） 3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐： 挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
1、接种于液体培养基上培养。
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、 0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。 5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉 淀原生质体。 6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高 渗缓冲液悬浮原生质体。
STC溶液：1.2mol/L Sorbitol，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisLogo
王金良学长： 1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层 擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养 23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100µL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。
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1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入 5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合， 导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养
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取原生质体悬液1mL与5mL上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生 培养基平板上，待培养基凝固后于28℃培养箱中倒置培养。用下式 计算再生率： 再生率（%）=（A-B）/C×100% 式中：A为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落 数；B为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数； C为显微镜下计数的原生质体数。
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取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用 无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻 抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样 观察。 （该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对 菌丝的伤害和杂菌污染）
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文献汇报
2011.3.3
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基
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高渗缓冲液： 《微生物学实验教程》 周德庆（酵母） 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
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以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中
置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放 情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶 解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
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1、将构建的pMD-pyrG质粒与100µL原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25µL预冷PTC，冰浴30 min； 2、再加入500µL上述PTC溶液，平静混匀，室温20min； 加入预冷1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl2 ，混匀； 3、与100mL米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板； 30℃培养4-7天。
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原生质体再生
酶种类和浓度 酶解温度 渗透压稳定剂 单一蜗牛酶，2% 30℃ 糖﹑醇类有利于原生质 体的再生而无机盐类物 质不利于再生（蔗糖） 0.8mol/L
再生培养基中蔗糖浓度
康氏木霉原生质体制备的最适菌龄为22h，蜗牛酶浓度为2.0%，酶 解温度为30℃，酶解时间为2.5h，蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为 0.6mol/L NaCl，再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8mol/L蔗糖