中温α-淀粉酶的酶学性质研究

Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ伐一Ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３
ＬＩＵ Ｙａｎｇ，ＳＨＥＮ Ｗｅｉ，ＳＨＩ Ｇｕｉ·ｙａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｘｉａｎｇ· （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ
１．７．６ 酶水解产物的硅胶板薄层层析 参考文献【８】的方法，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝２：ｌ：
１，上行展开两次。显色剂为４９二苯胺和４ｍｌ苯胺溶于 ２００ｍｌ丙酮和２０ｍｌ ８５％磷酸的混合液。硅胶板浸泡显色剂 后，在烤箱中９０℃烘１０～１５ｍｉｎ可见层析结果。
２ 结果与分析
２．１ 酶的分离纯化 粗酶液经过盐析、ＤＥＡＥ—Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ．７５
万方数据
１００
霎∞８０
髓４０
蒌２０
０
０
１５
３０
４５
６０
时间（ａｌｉａ）
１．蛋白质标准分子量；２．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５，３．ＤＥＡＥ．ｆａｓｔ ｆｌｏｗ；４．盐析。
图１ 纯化后的Ｂ．ａｍｙｌｏｆｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ａ－淀粉酶 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图片
Ｆｉｇ １
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａ·ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ａ－ａｍｙｌａｓｅ
麦芽糖标准曲线的绘制：配置浓度为Ｏ、ｌ、２、 ３、４、５ｐｍｏｌ／Ｌ的麦芽糖溶液，各取ｌｍｌ，６０℃保温 ５ｒａｉｎ，加入ｌｍｌ ＤＮＳ试剂，沸水浴５ｍｉｎ，蒸馏水稀释 至ｌ ０ｍｌ，测ＡⅢ。以麦芽糖浓度为横坐标、吸光度为 纵坐标绘制标准曲线。
酶活力测定在２０ｍｌ试管中依次加入０．９ｍｌ １％可溶性 淀粉溶液（ＮａＨ２Ｐ０４．柠檬酸缓冲液ｐＨ６．０配置），６０℃预 热５ｍｉｎ，再加入０．１ｍｌ酶液，６０℃保温５ｍｉｎ后，加入 ｌｍｌ ＤＮＳ试剂，沸水浴５ｒａｉｎ，蒸馏水稀释至１０ｍｌ，测 Ａｓ４０。与麦芽糖标准曲线对照得反应液麦芽糖浓度，计 算酶活力。
酶活力单位定义：在ｐＨ６．０、温度６０。Ｃ，５ｍｉｎ水 解可溶性淀粉释放ｌｍｏｌ还原物质（以麦芽糖计算）时所需 的酶量，为１个酶活力单位（Ｕ）。 １．５ 蛋白含量测定
按Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法测定【７】，以牛血清白蛋白绘制标准 曲线。 １．６ 电泳分析
ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析参照文献［８】，分离胶浓度为
１ ２％。 １．７ 酶学性质
１．７．１ 分子量测定 用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ法测定酶的分子量，根据已知分子量
的标准蛋白在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中的相对迁移率Ｒｆ，作Ｒｇｌｏｇ Ｍｒ图，求得其分子量。
１．７．２ 最适反应温度及热稳定性 在不同温度下按照标准方法测定酶活，以酶活最高
者为１００％。将酶液在５５、６０、７０＂Ｃ，分别保温１５、３０、 ４５、６０ｍｉｎ，放置冰上迅速冷却至室温，按标准方法，测 残余酶相对活力，以未保温的酶液的酶活为１００％。
１．７．４ 金属离子和化学试剂对酶活力影响 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ的不同金属离子、ＥＤＴＡ和ＳＤＳ溶液分别
与ｌ％淀粉溶液等体积混合，作为底物。各自加入淀粉 酶液，测定酶相对活力，以只含淀粉底物的正常条件 下测定酶液的活力为１００％。
１．７．５ 动力学常数测定 在不同底物（可溶性淀粉）浓度的反应体系中，
６０℃反应５ｍｉｎ，测定Ａｓ４０以计算酶反应的初速度，作 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ．Ｂｕｒｋ双倒数图。
标准分子量蛋白Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；其它试剂均为 国产分析纯。 １．２ 仪器
ＡＫＴＡ．Ｅｘｐｌｅｒｌ００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ一７５ ＤＥＡＥ·Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 美 国惠普公司。
收稿日期：２００７．０９．２１ 基金项目：新世纪优秀人才支撑计划项目（ＮＣＥＴ．０４．０４９７）：国家“８６３”项目（２００６ＡＡ０２０２０４） 作者简介：刘洋（１９７５．），男，博士研究生，研究方向为工业微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｙａｎ９１９７５７２６＠１２６．ｔｏｍ ·通讯作者：王正祥（１９６４一），男，教授，博士，研究方向为工业微生物资源与育种，分子微生物学。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂 菌种Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３保存于中国高校工业
微生物资源和信息中一ｔ），（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｃｉｍ－ｃｕ．ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ）， 菌种保藏编号ＣＩＣＩＭ Ｂ２１２５。摇瓶发酵培养基组成为： １％胰蛋白胨，０．５％酵母膏，Ｏ．５％ＮａＣｌ。２５０ｍｌ摇瓶 装５０ｍｌ上述培养基，于３７℃，２５０ｒ／ｒａｉｎ培养９６ｈ。
※生物工程
良品科学
２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．０９ ３７３
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ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｌｅ，Ｃａ２＋，Ｍｎ２＋ａｎｄ Ｃ０２＋ｉｏｎｓ ａｒｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．１（ⅢａｎｄＶ—ｏｆａ—ａｍｙｌａｓｅ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ｉｓ ４．３３ ｇ／Ｌ ａｎｄ １．１９ ｇ／Ｌ。
ｒａｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ａｒｇ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｄｅｘｔｒｉｎ．
＾摹一船髓靛罂
温度（℃）
图２ 温度对８．ａｍｙ／ｏ／ｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ａ－淀粉酶活性的影响 Ｆｉｇ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｏｆ，·ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ８．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３
２．２．３ Ｃａ２＋对酶的热稳定性影响 在反应体系中分别添加２、５、ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋，并
在不同温度（５５、６０、７０℃）下保温。实验结果表明： 无Ｃａ２＋存在情况下，Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ０ｃ．淀粉 酶，在５５℃下保温ｌ ５ｍｉｎ，基本丧失活力，但在添加 ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ或ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋存在情况下，对酶的热稳 定性有很大提高，５５℃保温６０ｍｉｎ，分别残留７０％或８５％ 以上活力（图３Ａ）；酶液在６０℃保温下，添加５ｍｍｏＶＬ或 １０ｎｕｎｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋，酶液保温１ｈ，分别残留６０％或８５％以 上活力（图３Ｂ）．酶液在７０℃保温时，添加１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋，保温１５ｍｉｎ还残留５０％活力，而添加５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋，酶液保温１５ｒａｉｎ，基本丧失活力（图３Ｃ）。说明Ｃａ２＋ 对酶的热稳定性影响很大，１０ｍｍｏＶＬ Ｃａ２＋能显著提高酶 的热稳定性。
２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ａ－Ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉ自ｆｕｅｆａｃｅｎｓ Ｍ２３ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａ－ａｍｙｌａｓｅ ｉｓ ５８ ｋＤ．Ｉｔｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ ５．５ ｔｏ ６．５．ａｎｄｔｈｅ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ；ａ－ａｍｙｌａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
中图分类号：Ｑ５５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００２．６６３０（２００８）０９－０３７３－０５
ａ．淀粉酶（ＥＣ ３．２．１．１）以糖源或淀粉为底物，从分子 内部切开ａ．１．４糖苷键而使底物水解，产生糊精、寡糖、 麦芽糖、葡萄糖等产物。它是一种非常重要的工业用 酶，广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤、医药等
中温仪一淀粉酶的酶学性质研究
刘洋，沈微，石贵阳，王正祥· （江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡
２１４１２２）
摘要：通过盐析、ＤＥＡＥ．ＦＦ和Ｓｕｐｅｒｄｅｘ．７５，对Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３产生的伍·淀粉酶进行了纯化， 得到电泳纯的ａ．淀粉酶，纯化倍数为２９．６ｌ，活力回收率为２０．０６％。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得该酶的分子量为５８ｋＤ。 该酶的最适反应温度为５５℃，最适反应ｐＨ值为６．０。纯酶液在ｐＨ７．Ｏ～１０．０缓冲液中室温放置２４ｈ，可保持８０％ 以上活力。５５℃保温１５ｍｉｎ，基本丧失活力，添加１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｃａ２＋能显著提高酶的热稳定性。Ｃａ２＋、Ｍ９２＋和 Ｃ０２＋具有激活该酶活性的作用，ＥＤＴＡ抑制酶的活性。６０℃，以可溶性淀粉为底物的Ｋｍ，Ｖ一，分别为４．３３９／Ｌ、 １．１９９／Ｌ·ｒａｉｎ。薄层层析结果表明该酶水解淀粉生成糊精和寡聚糖。 关键词：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ；ａ．淀粉酶；纯化；性质
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｘｗａｎｇ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据
３７４ ２００８．Ｖ０１．２９．Ｎｏ．０９
食品科学
※，Ｅ物工程
１．３ ａ一淀粉酶的分离纯化 全部操作均在室温进行。发酵液６０００ｒ／ｒａｉｎ离心
１０ｍｉｎ去菌体，所得上清液为粗酶液。粗酶液进行８０％ 饱和的硫酸铵盐析沉淀，８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，沉淀经 去离子水透析，冻干后，用３ｍｌ柠檬酸一磷酸氢二钠（ｐＨ６． Ｏ）缓冲液溶解后，上ＤＥＡＥ．Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换柱（１６ ｍｉｌｌ×１００ｍｍ），基础缓冲液为２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ ８．６），用含Ｏ～ｌｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ的基础缓冲液进行线形洗脱， 洗脱速度为２ｍｌ／ｍｉｎ，收集合并酶活峰后，上预先经 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ６．５）缓冲液平衡好的Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５层 析柱（２６ｍｍ×６００ｍｍｌ进行洗脱，洗脱速度２ｍｌ／ｍｉｎ，收 集合并酶活峰，经去离子水透析，冻干，用于酶学性 质研究。 １．４ 酶活力测定
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｓ ６０℃．
Ｗｉｔｈ ｉｎ ２４ ｈ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ８０％ｅｎｚｙｍｅ ａｅｔｉｖｉｔｙ ｋｅｅｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ ７．０ ｔｏ １０．０．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｏｓｅｓ
ｗｉｔｈｉｎ １５ ｍｉｎ ａｔ ５５℃．＆止ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｓｔａｂｌｅ ｆｏｒ １ ｈ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌＯ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋．ＥＤＴＡ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｅ啦ｚｙｍｅ
工业【ｌ－，】。在不同工业中，需要应用不同酶学性质的ａ． 淀粉酶。酒精工业需要高温酸性伍一淀粉酶：纺织、造 纸工业需要中温ａ．淀粉酶；洗涤工业需要碱性ｏｔ．淀粉 酶。产生ａ．淀粉酶的微生物种类很多，有细菌，真菌 来源，不同种属微生物所产生的０‘一淀粉酶性质也有所差 异问。相对于其他淀粉水解酶，来源于Ｒ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ 的中温淀粉酶，一直未得到深入研究。本研究对曰． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ａ一淀粉酶的进行了纯化和酶学性 质研究。
２．２．１
分子量
用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ法测得，Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３
ａ一淀粉酶分子量约为５８ｋＤ，电泳图见（图１）。
Leabharlann Baidu
２．２．２ 酶的最适反应温度 在不同温度下测定酶的活力，实验结果表明，曰．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍ２３ ａ一淀粉酶在３０～９０ ｏｃ的温度范围 内都有活力，最适反应温度为５５℃，在４０～７０℃有较 高活力，７０℃以上活力较低（图２）。
１．７．３ 酶的最适反应ｐＨ值及ｐＨ值稳定性
将酶液分别用ｐＨ３．０～６。０柠檬酸柠檬酸钠缓冲液， ｐＨ６．Ｏ～８．０磷酸氢二钠．柠檬酸，ｐＨ８．Ｏ～９．０ Ｔｉｓ．ＨＣＩ缓 冲液，ｐＨ９．５～ｌＯ．５硼酸．氢氧化钠缓冲液稀释，按标 准方法测酶活力，以酶活最高者为１００％。用相同的缓 冲液稀释，２５℃保温２４ｈ后，测残余酶相对活力，以 未保温的酶液的酶活为１００％。
凝胶过滤层析等纯化步骤后，最终酶的比活提高了２９．９６ 倍，酶活回收率为２０．０６％。将酶蛋白样品进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ凝胶电泳，表明为一条带，电泳结果见图１，以 上各步提纯结果列于表１。
Ｔａｂｌｅ １
表１淀粉酶纯化总表 Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ０【－ａｍｙｌａｓｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．２ 酶的基本性质