蛋白质免疫印迹技术常见问题分析 (1)
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析44页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的免疫印迹技术及常见问题分析
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
WB过程中常见问题及处理方法
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数； 3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应
——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化
c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤 +海绵+阳极碳板，不能放反
d转膜过程产生大量的热，注意冷却
e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定； 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间 越长，反之则短
f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手 上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜 脏掉。
5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数，增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
• 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二 抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。 可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性
• 更换更好的一抗二抗
2、一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度； 长孵育时间；
2、制胶 根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净， 不能有残留的胶。 玻璃板底部放平，尽量不能漏胶 灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝 水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转 移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形
Western_Blot详解及问题分析.
1. 抗体长期保存应在－70℃
，使用前做效价检测
对 2. 增加蛋白上样量，做已知
策
标准量蛋白的对照
3. 减少漂洗的时间和次数
Western Blot
出现非特异带 原因
1. 一抗不是唯一特
异的
对
2. 二抗出现非特异 策
结合
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点
蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析
张绍进
Western Blot
Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot
Western Blot 简介：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
Western Blot
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 ➢ 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。 ➢ 有机溶剂提取法
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
免疫印迹中的问题
我做的WB中检测两个目的基因，一个是90kd，一个是42kd，内参是36kd，请问一下我这个怎么做才有可比性，后面一个目的蛋白和内参大小差不了多少，如果是一块胶的话，剪膜也不能剪。
谢谢大家！这个很容易做，跑两个膜，每张膜上分别Blot两个目的基因，只要保证两个膜使用的都是同样来源的样品就好。
然后在分别strip掉blot内参基因。
如果你非要在一张膜上做的话，取决于你的前两个目的基因使用多抗还是单抗，使用抗兔的二抗的话，你可以先加一个基因的一抗，再加另一个基因的一抗，然后用抗兔的二抗一次将两个基因同时Blot出来。
一般内参基因都是单抗，所以将blot过的膜很轻微的strip一下，去除掉抗兔的二抗即可进一步blot内参，这样两个的结果都没有互相的干扰。
但是你一定要记得，不管你怎么做，内参一定要最后才能blot，如果你先blot了内参，由于内参蛋白在膜上的量实在太大，导致化学发光很强，你在后来无论如何strip还是blot 你的目的基因，都没办法拿到很好的结果。
1．为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。
常用的几种内参。
3。
不同的情况如何选择不同的内参。
1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。
这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。
这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。
严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
蛋白质印迹技术及实验中常见问题分析
Western blot ：
➢ 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗 体反应进行特异性目的蛋白的检测的过程。
➢ 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检 测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可 到10－100pg）的靶蛋白。
Western blot ：
在待分离蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用。常见的凝胶电泳缓冲液有两 种： Tris-甘氨酸：分离范围宽，可用于分离分子量
•快速5～15分钟， 颜色稳定； •深浅随不同蛋白质 变化; •标准曲线有轻微的 非线性
•较快40分钟内， •抗干扰能力强
二.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫 酸钠）
同时电泳系统中存在强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，使得ＳＤＳ-ＰＡＧＥ的电泳中 的蛋白处于完全变性状态
概论
Sout概her论n blot
The Southern blot is used for DNA analysis and was routinely used for genetic fingerprinting and paternity testing prior to the development of microsatellite markers for this purpose.
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合呈蓝 色，在波长595nm 吸收峰，在一定的 范围内与蛋白质的 含量呈线性关系
高 （约1～5μg/ml）,
BCA法基于双缩脲 很高 原理，碱性条件下 （0.5-20μg/ml ） 蛋白质将Cu2+还原 成 Cu+ ，BCA螯合 Cu1+ 作为显色剂， 产生兰紫色并在 562 nm有吸收峰
WB常见问题分析
WB常见问题分析蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )是很常规的生物学实验，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
嗯，听起来不错，不过真正在实验室里做实验的小伙伴恐怕都遇到过各种实验结果不完美的状况，做了很久的WB，走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
下面我们列举一些常见问题一个个分析。
1胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1）二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；2）ECL底物中H2O2不稳定，失活；3） ECL底物没覆盖到相应位置；4）一抗选择不当；5）二抗失活。
2背景高咋回事？答：可能的原因有：•膜没有完全均匀湿透,建议使用100% methanol浸透膜；•洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数；•电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样；•封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；•封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；•封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；7）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间11）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物3为啥条带形状不好看？答：可能的原因有：1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀4蛋白条带位置（大小）不对咋整？答：可能的原因有：•胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度•抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
WB实验常见问题与解决方案讲座
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白） 膜蛋白 核蛋白
Tris-Triton NP-40 or RIPA RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
Triton-X100，NP-40，SDS和脱氧胆酸钠
试剂名称
作用推荐
Triton-X100 NP-40
Western blot (WB) analysis of EGFR (phospho-Y1086) pAb （BS4706） at 1:500 dilution. Lane1:Hela whole cell lysate(40ug) Lane2:Hela treated with H2O2 (100nmol/ml, 28min) whole cell lysate (40ug) Lane3:Hela treated with H2O2 (100nmol/ml, 28min, λ-ppase) whole cell lysate(40ug)
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
Western blot发光检测中常见问题及解决办法
现象
原因
解决办法
信号弱或无
背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）1. Western blot结果中的背景为什么较高?可能的原因及建议1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
7.一抗不纯——纯化抗体8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。
其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。
众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。
拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。
在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。
ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。
图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。
现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。
在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。
首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。
WB 过程中常见问题1
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
WB 实验中常会出现各种问题问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议4℃ 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。
洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
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常见问题分析
一.无信号
一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白：使用高浓度抗体。
4 °C 延长孵育时间（如过夜）。
封闭剂与一抗或二抗有交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。
一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量不低于20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
组织中目的蛋白含量低：浓缩使信号最大化。
转膜不充分：使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。
PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
洗膜过度：勿过度洗膜。
过度封闭使目标蛋白不能显色：使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。
一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。
二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。
检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底物。
二．背景高
未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。
一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间（耗时长但特异性结合最好）。
二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。
未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。
选膜不当产生的高背景：硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。
膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。
三．多带现象
细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：参考文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。
蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。
检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白：查阅其它文献报道，或BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带：降低抗体浓度和/或孵育时间。
二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合：降低抗体浓度，加入二抗对照（不加一抗）。
抗体未经纯化：使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。
目标蛋白形成多聚体：SDS-PAGE 电泳加样前，煮沸10 分钟而不是5 分钟，使蛋白质解聚。
四．背景有不均匀的白色斑点
转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均：转膜过程中尽量除去气泡，抗体孵育时保持摇动。
五．背景有黑色斑点
抗体结合了封闭剂：过滤封闭剂。
六．深背景出现白色条带
一抗或二抗加入过多：稀释抗体的浓度。
七．目的条带染色过低/过高
分离不彻底
改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。
八．条带“微笑”效应
1. 迁移过快
2. 电泳温度过高（改变了pH 值和迁移速度）
降低迁移速度或低温电泳（冷库或冰上）。
九．相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带
制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀
参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。
十．凝胶染色不均匀
1. 细菌污染
2. 抗体量不足
1. 4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。
2. 确保振荡条件下孵育膜或抗体充分覆盖膜。