Lux手性分析方案
利斯的明中间体立体拆分菌株的筛选与鉴定
利斯的明中间体立体拆分菌株的筛选与鉴定周方方;付路平;李永红【摘要】The screening of 44 strains from soil that could resolute Rivastigmine was conducted. By using TLC, HPLC and NMR analysis methods, a strain numbered Rnn02 was identified, which had the highest resolution efficiency for racemic Rvastigmine. It was identified to be Meyerozyma guilliermondii by mor-phology and it’s 18S rDNA analysis.%自土壤中筛选出44株能够拆分利斯的明的菌株。
通过薄层色谱、高效液相及核磁分析发现一株菌种编号为Rnn02的菌株对利斯的明外消旋物的拆分效率最高。
通过菌株形态学及18S rRNA基因序列分析确证该菌株为季也蒙毕赤酵母( Meyerozyma guilliermondii)。
【期刊名称】《郑州大学学报（理学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】6页(P71-75,80)【关键词】利斯的明;拆分;鉴定【作者】周方方;付路平;李永红【作者单位】郑州大学药学院郑州450001;郑州大学药学院郑州450001;郑州大学药学院郑州450001; 郑州大学新药研究开发中心郑州450001【正文语种】中文【中图分类】TQ460.1利斯的明(Rivastigmine)，又称卡巴拉汀，化学名(S)-N-乙基-[3-(1-二甲基氨基)乙基]-N-甲基-氨基甲酸苯酯，结构式如图1，是氨基甲酸酯类脑选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能够选择性地作用于大脑区域内并且有长持续时间的活性[1-2].利斯的明的酒石酸盐的商标名称为艾斯能(Exelon).它对轻中度阿尔茨海默症(AD)有温和节制效果，对震颤麻痹[3]和路易小体[4]引起的痴呆症以及血管性痴呆[5]也同样具有良好的治疗效果.临床研究证明其耐受性和安全性较好，无肝脏毒性，是唯一不经过P450代谢的药物，其疗效较其他胆碱酯酶抑制剂更好.近几年随着酶固定化、生物反应器等多种生物技术的飞速发展，生物拆分中的酶法具有副反应少、立体选择性强、拆分效率高、成本低、周期短、不受季节影响、能重复利用、可大规模生产并且环保等优点，因此在手性化合物制备中逐渐引起大家的极大兴趣.在今后，化学法与酶法的结合将是制备手性化合物的新切入点.文献[6]在2009年报道了化学-酶法制备S型利斯的明的方法，反应条件温和、产率(77%)及光学活性较高(ee值97%)，但动态动力学拆分(DKR)所用金属钌配合物及脂肪Novozym-435价格昂贵.因此，筛选立体选择性强、催化效率高且稳定性好的微生物酶，并在此基础上开发出具有自主知识产权的制备S型利斯的明的新工艺，具有重大意义.本文筛选出一株可以高效拆分利斯的明中间体的菌株，意义重大，有应用于工业化的潜质.生物拆分所用的酶大部分由微生物产生，因此本研究旨在筛选合适的微生物，为利用化学-酶法制备利斯的明的研究做准备.1.1 仪器核磁共振(瑞典Bruker DPX-400型超导核磁共振仪)，高效液相色谱(Waters 1525).HYG-Ⅱa 型自动摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，R-1005型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，Waters 1525高效液相色谱仪，色谱柱为Lux 3u Cellulose-1柱(4.6 mm×250 mm×3 μm，美国Phenomenex公司)， DP-88型SensoQuest LabCycler系列PCR仪.1.2 材料与试剂底物(化学物2)自制，利用HPLC图谱通过归一化法计算纯度为98.3%，琼脂粉、蛋白胨、酵母膏、丙酮、葡萄糖、乙酸乙酯及其他试剂均为分析纯.1.3 菌株的筛选和鉴定1.3.1 样品来源从郑州、南阳、南宁、柳州、济南、北京6个地区采集到富含油脂的6份土样.1.3.2 培养基斜面保藏培养基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，琼脂23，葡萄糖10，pH自然.富集培养基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，葡萄糖10，pH自然.平板分离培养基(g/L)：以底物为唯一碳源，NH4NO3 1.0，底物10，NaCl 10.0，K2HPO4 1.5， KH2PO40.5，MgSO4 0.2，琼脂23， pH自然.罗丹明B选择培养基(g/L)：橄榄油15，酵母膏20，蛋白胨50，琼脂粉23，罗丹明B 2， pH自然.斜面保藏LB培养基(g/L)：酵母膏 5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂20，pH 7.5.转化培养基(g/L)配方：玉米浆5，蛋白胨10，蔗糖20， pH 8.0(Tris-HCl缓冲体系).配制方法见文献[7-13].1.3.3 菌株的筛选 1) 称取1.5 g土样，溶于无菌水中，振荡器震荡10 min后，将上层清液倒入富集培养基中培养48 h.2) 将1)中培养液用无菌水稀释后，涂布至以底物为唯一碳源的选择性平板上，于28 ℃培养.3) 将2)中长出的菌落挑出，分离纯化至单菌落.4) 将3)中纯化后的菌种用罗丹明B指示平板，28 ℃培养48 h后，进行复筛.在365 nm紫外灯下观察，产脂肪酶的菌株周围有红色的荧光环.5) 将4)中筛选出的菌种摇瓶发酵培养后，加入0.1% 底物进行拆分试验，用TLC法检测有无产物生成，保留有产物点的菌株.6) 将5)中筛选出的菌种经摇瓶发酵培养后，加入0.1%底物进行拆分试验，用乙酸乙酯萃取3次后，蒸干溶剂，用HPLC法检测产物的ee值，选出ee值最高的菌种保留.7) 将拆分产物经柱色谱提纯后用核磁共振仪(NMR)测定其结构.根据TLC、HPLC和NMR结果确定目的菌株.1.3.4 转化条件以10% 的接种量将培养48 h后的种子液转接入含110 mL 液体培养基的三角瓶中，于28 ℃，220 r/min条件下培养16 h.发酵液以5 000r/min 离心10 min，得到的湿菌体用缓冲溶液洗涤后悬浮于相同的缓冲液中，加入底物后在相同条件下进行转化16 h.利斯的明和中间体的拆分是由微生物菌体中的脂肪酶催化的，酶催化受各种因素调控.因此脂肪酶活性并不能更好地表示优化效果，故用转化率来表示转化效果.用转化16 h后目的产物量占加入底物量的百分比来表示转化率.1.3.5 菌株的鉴定菌落形态特征按常规方法进行[14].在初步判断菌种类型的基础上，采用分子生物学鉴定方法以其18S rRNA进行基因序列分析，PCR扩增并测序，引物设计及反应参数参照文献[15].在NCBI数据库中将测序结果Blast比对分析，进行最后鉴定.1.4 菌株转化产物的分析和计算方法1.4.1 转化产物的提取用相同体积乙酸乙酯萃取转化液3次，得到乙酸乙酯相，用饱和的NaHCO3洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，最后再用蒸馏水洗1次.将得到的饱和NaHCO3相和饱和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并所有有机相，无水Na2SO4干燥后用TLC和HPLC法测定.1.4.2 TLC分析方法将样品点于硅胶GF254薄层板上，氯仿∶甲醇(10∶1，V/V)为展开剂进行检测.1.4.3 HPLC分析方法及ee值计算方法固定相为手性Lux 3u cellulose-1柱，正己烷-异丙醇(92.5∶7.5)为流动相，检测波长217 nm，柱温25 ℃，流速0.8mL/min进行HPLC分析.据样品在HPLC图谱中的峰面积计算ee值.公式为：2.1 菌株的筛选经过初筛得到能够在以底物为唯一碳源的平板上生长的44株菌株，用LB斜面培养基保藏菌种，用于后续研究.采用罗丹明B平板筛选法[16-17]对初筛出的44种菌株进行复筛，由于脂肪酶或酯酶可将平板上的油脂降解产生脂肪酸，脂肪酸可以与罗丹明B阳离子发生反应，形成的物质在紫外灯下显现橙黄色荧光现象(如图2).因此若菌株产生脂肪酶或酯酶，其周围会出现荧光圈，罗丹明B平板筛选法筛选出19株有荧光的菌株.分别将罗丹明B平板筛选法筛选出有荧光的19种菌株进行摇瓶发酵培养，转化底物，用乙酸乙酯萃取转化液，然后用薄层色谱法进行产物监测，从中得到14株有产物点出现的菌株.分别将薄层色谱法筛选出的14种菌株摇瓶发酵培养，转化底物，用HPLC法进一步测定，结果如表1所示.由表1所示，编号Rnn02的菌株ee值和转化率均较好，菌株Gxnno2B、Gxnno1A和zz03虽然转化率较高，但是ee值过低，菌株zz01C的ee值虽然较高，但是转化率较低.综合考虑Rnn02菌株对外消旋底物的拆分效果最好，可能是符合要求的菌株.2.2 高效拆分菌株的确定2.2.1 HPLC法验证利用Rnn02菌株催化拆分的反应体系(包括反应底物和产物)和利用文献中所用的Novozym453酶催化拆分的反应体系的HPLC色谱保留时间进行比较(见表2，图3和图4).从图4及表2可以看出新出现化合物(R)-1和化合物(R)-2的峰面积小于(S)-2的峰面积，说明化合物(R)-2部分转变成(R)-1，而(S)-2的峰面积基本不变，且没有(S)-1的峰出现，说明得到的拆分产物是化合物(R)-1.HPLC谱图前面基线不太平稳，这是由于所用的正己烷和异丙醇均为分析纯，保留时间小于8 min的峰是溶剂中含的杂质.对化合物1、化合物2及消旋化合物1转化12 h后产物的HPLC谱图结果分析得出，化合物1的R-异构体和S-异构体保留时间分别为(17.045±0.3) min 和(14.618±0.2) mi n，化合物2的R-异构体和S-异构体保留时间分别为(10.334±0.3) min和(12.037±0.3)min.2.2.2 核磁氢谱对比分析转化产物的1HNMR谱图解析显示：1HNMR(400MHZCDCL3),d7.31(t,1H,Ar-H),d7.17(d,1H,Ar-H),d7.12(s,1H,Ar-H),d7.00(d,1H,Ar-H),d4.86(q,1H,PHCHCH3),d3.42(dq,2H,NCH2CH3),d3.14(d,3H,NCH3),d2.2(s, 1H,OH),d1.44(d,3H,PHCHCH3),d1.22(dq,3H,NCH3).为进一步确定进行拆分的化合物的种类，将转化产物的1HNMR谱图与化合物(R)-2的1HNMR谱图进行比较分析(见图5)，发现两张谱图完全一样，因此进一步确定转化拆分的是(R)-2.通过对拆分反应底物和产物的HPLC保留时间及核磁氢谱的研究，从而确定编号Rnn02的菌株是符合本研究要求的菌株.2.3 菌株的鉴定分析菌株在不同培养基上具体形态不同，通过观察菌落形态、菌体形状和大小、有无孢子和菌丝生成以及繁殖方式对菌种进行初步鉴定.Rnn02菌株在不同培养基上的共同特征如下：呈乳白色，表面褶皱，有光泽，湿润，无孢子和假菌丝，呈黏稠状，无特殊气味，细胞有椭圆形(4 μm×4.5 μm～5.5 μm×6 μm)和圆形(4.5 μm)两种类型.生长方式多数为裂殖，少部分为芽殖.根据编号Rnn02的菌株的细胞形态和菌落形态的结果及与相关资料对比，初步判断该菌为酵母菌.最后用分子生物学手段做最终鉴定.以酵母菌保守序列18S rRNA进行基因序列分析，PCR扩增并测序.在NCBI数据库将测序结果用Blast比对同源分析.鉴定出该菌为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii).经过初筛、复筛，通过TLC、HPLC、NMR分析发现一株编号为Rnn02的菌株对利斯的明中间体外消旋物的拆分效率最高.经菌落形态分析及分子生物学手段确定为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)，并已于2012年12月7日经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.6783.该菌株可对手性中心含有酰基或羟基的化合物进行对映体拆分，拆分所得产物单一，拆分效率高，价格低廉，工艺简单，有应用于工业化生产的潜力. [1] 宫鹏飞，许建和，沈端,等.(R)-酮基布洛芬乙酯对映选择性水解酶产生菌的筛选及其特性[J].应用与环境生物学报，2001，7(6)：582-587.[2] 王荫华，陈清棠，张振馨,等.卡巴拉汀治疗阿尔茨海默病患者的临床研究[J]. 中华神经科杂志，2001(34)：210-213.[3] Reading P J, Luce A K, Mckeith I G. Rivastigmine in the treatment of parkinsonian psychosis and cognitive impairment: Preliminary findings from an open trial [J]. Movement Disord, 2001，16(6): 1171-1174.[4] Ian M K, Teodoro D S, Pier F S, et al. Efficacy of rivastigmine in dementia with Lewy bodies: a randomised, double-blind, placebo-controlled international study [J]. The Lancet, 2000，356(9247): 2031-2036.[5] 陈霞，张振馨，钱彩韻,等.卡巴拉汀治疗血管性痴呆的开放性多中心随机对照研究[J].中华神经科杂志，2005，38(8)：483-487.[6] Kiwon H, Cheolwoo K, Jaiwook P, et al. Synthesis of Rivastigmine via dynamic kinetic resolution as a key step[J]. 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手性色谱分析(Dr.Yuan)
手性固定相（CSP） 手性固定相（CSP）法
间接法：柱前衍生 • 优点：
*可采用通用的非手性柱分离 *通过衍生化可提高检测灵敏度 *分离条件简单 *分离效果好
• 缺点：
*要有可被衍生化的基团 *要有高光学纯度的手性试剂 *对个对映体衍生化率速和平衡常数应一致 *衍生化和色谱过程中不能发生消旋化
间接法：柱前衍生
常用的手性化合物测定技术 • 高效液相色谱 (HPLC)
• • • • 气相色谱 (GC)(样品需具有一定的挥发性及热稳定性） 毛细管电泳(HPCE) 超临界流体色谱（SFC) 流动模拟床技术
HPLC
• 80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离 和测定最为广泛应用的方法。 • 特别适用于极性强、热稳定性差的手性药 物的分析。 • HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途 径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
冠醚固定相结构
大环抗生素型（Macrocyclic antibiotics） 大环抗生素型（Macrocyclic antibiotics）
hydrogen bonding & dipole stacking sites amine
H3 C NH HO H O NH O O NH NH HO O O NH COOH NH 2 HO OH
含肽或蛋白质手性固定相
Characteristics
Peptide chain: Carbohydrate content: Molecular weight: Isoelectric point (pI) 183 aa 45% 40000 2.7
• CHIRAL-AGP
Chiral-AGP固定相是a-酸性糖蛋白(alpha1-acid glycoprotein), 这种非常稳定的蛋白质被键合到5um 球型硅胶表面, 能够耐受高比例有机流动相, 宽范围 的pH, 以及更高的操作温度. Chiral-AGP用于反相色 谱, 能够分离数量非常多的各种手性化合物.
手性分析条件的建立和优化手性分析中的注意事项
目
CONTENCT
录
• 手性分析简介 • 手性分析条件的建立 • 优化手性分析中的注意事项 • 手性分析的应用和发展趋势 • 结论
01
手性分析简介
手性的定义
定义
手性是指一个物体与其镜像不能重合的特性。在化学中，手性主 要与分子的空间构型有关，即一个分子与其镜像分子在空ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ结构 上无法完全重合。
02
手性分析条件的建立
分离条件的选择
分离介质
选择适合手性分离的介质，如手性固定相或手性流动 相添加剂。
流动相组成
根据分离需要，调整流动相的组成，如有机溶剂、缓 冲液、添加剂等。
流速
流速的改变会影响分离效果，需根据实际情况调整。
检测条件的选择
检测波长
选择适当的检测波长，以最大程度地响应手性 分子的差异。
示例
自然界中的许多化合物，如氨基酸、糖类和蛋白质，都存在手性 。这些化合物的手性形式通常与其生物活性密切相关。
手性分析的意义
80%
生物活性
许多具有手性的化合物在生物体 内具有独特的生物活性或毒性， 因此手性分析对于药物研发和食 品安全等领域具有重要意义。
100%
分离纯化
手性化合物在混合物中的存在可 能导致分离纯化的困难，因此手 性分析有助于指导分离纯化过程 。
参照物和标准品应具有代表性，能够覆盖分析范围 内的所有可能情况。
在分析过程中，使用参照物和标准品进行校准，以 提高准确度。
注意操作细节和实验误差
1
严格按照操作规程进行实验，避免误差的产生。
2
在实验过程中，注意观察并记录异常现象，以便 及时处理。
细胞内分子手性的研究方法和应用
细胞内分子手性的研究方法和应用细胞是生命体系中的基本单位，其中包含了各种生物大分子，如蛋白质、核酸等。
在分子层面上，手性是一个重要的概念。
生物大分子的手性对于它们的结构和功能有着决定性的影响。
因此，研究细胞内分子手性对于理解细胞内生化过程和开发新药具有重要意义。
目前，研究细胞内分子手性的方法主要包括1）催化剂选择性剖面质谱（CSS-MS）2）化学方法3）计算方法。
一、催化剂选择性剖面质谱（CSS-MS）催化剂选择性剖面质谱技术是一种利用手性选择性催化剂鉴定混合物中手性分子的方法。
这种技术包括两个步骤：将混合物与一些催化剂反应，然后将反应产物进行质谱分析。
在这种技术中，手性选择性催化剂扮演着重要的角色。
催化剂能够特异性识别并催化产生同一对映异构体的手性底物。
因此，在催化过程中，手性底物会被选择性地转变为具有一定手性的产物。
通过对不同手性底物的不同催化反应进行MS检测，可以对样品中的手性混合物进行分析。
利用CSS-MS技术可以研究各种生物大分子的手性，包括蛋白质、核酸等。
通过这种方法可以解析复杂的样品，得到各种手性配体的相对含量。
与其他技术相比，这种方法具有快速、灵敏、高效和准确的优点。
二、化学方法化学方法是研究细胞内分子手性的另一种重要方法。
这种技术主要通过化学反应来探究手性分子的结构和活性。
其中一种常见的化学方法是利用手性分子的反应速率差异进行分析。
手性分子在互相反应时会形成两种异构体，具有不同的反应速率。
利用这种分子间速率差异的特性，可以将手性分子分为对映异构体，并对它们进行分析。
这种方法主要应用于小分子的手性分析。
另外，化学方法还可以通过反应产物的手性、手性接触等方面来研究细胞内大分子的手性。
例如，利用酶的手性催化性质来研究蛋白质、核酸等大分子的手性。
三、计算方法计算方法是一种基于计算机的技术，用于模拟生长在三维空间中的手性分子的结构和活性。
计算方法能够预测同分异构体的相对结构稳定性，从而判断手性分子的可能构型。
大赛璐手性柱注意事项
避免将手性柱暴露在强磁场或电场中，以防影响分离效 果。
使用后应将手性柱妥善存放，避免过度震动或碰撞。
03
使用过程中的注意事项
操作步骤
确保手性柱的安装稳固，避 免在使用过程中发生倾斜或 移动。
流动相的流速应保持稳定， 避免过快或过慢，以免对手 性柱造成损害。
在使用前，应先对手性柱进 行充分的平衡和排气，确保 柱内无气泡。
避免与强氧化剂接触
手性柱应远离强氧化剂和腐蚀性物质，以防损坏。
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感谢您的观看
使用过程中，应定期检查手 性柱的性能，如有问题应及 时处理。
安全防护
使用手性柱时应佩戴化学防护 眼镜和实验服，防止意外伤害
。
避免使用带有腐蚀性和氧化性 的流动相，以免对手性柱造成
损害。
在使用过程中，应保持室内通 风良好，防止有害气体积累。
对于易燃、易爆或有毒的试剂 和气体，应严格按照安全规定 进行操作。
适用范围
01
02
03
手性分离
适用于各种手性化合物的 分离，如氨基酸、糖类、 药物等。
生物活性物质分离
可用于生物活性物质如酶、 抗体和细胞等的分离纯化。
复杂样品分离
适用于复杂样品中手性化 合物的分离，如代谢产物、 天然产物等。
操作原理
手性识别
大赛璐手性柱通过手性固 定相与手性化合物的相互 作用，实现对手性分子的 拆分。
柱效降低
总结词
柱效降低可能是由于固定相流失、柱污染或长时间使用导致的。
详细描述
为解决柱效降低的问题，可以检查色谱柱的固定相是否流失，对色谱柱进行适当的清洗和维护。如果色谱柱使用 时间过长，可能需要更换新的色谱柱以恢复其性能。同时，确保流动相的质量和清洁度也是避免柱污染的关键措 施。
【分离科学与技术】4手性物质分离分析方法及其应用
更为奇妙的是，当把这两种晶体的溶液等量混合 以后，偏振光不发生偏转。由此，巴斯德断定酒石 酸分子拥有一种镜像物质，它们彼此的旋光性相反， 具有不同的空间构型。
1904年，英国物理学家，开尔文勋爵 (Lord Kelvin)在巴尔的摩的一次演讲上第一次提 出了手性的概念(Chirality)，并且定义为任何一个 不能与其镜像完全重叠的几何构型或者点群都可以 说其具有手性。
5
2、手性及对映异构体的定义
物体与其镜像不能叠合的现象称为手性 (Chirality)。
两种互为镜像关系且不能重叠的分子称为手性 分子，或对映异构体(Enantiomorph)。
互为对映体的手性分子
6
3、手性分子的特点
手性分子或对映异构体的结构差别很 小，具有相同的熔点、沸点、偶极矩、折 光率和光谱性质等。与非手性试剂作用时， 其化学性质也一样，很难用一般的物理或 化学方法区分。
22
为了克服液膜的不稳定性，固膜得到了很大的发 展。在固膜中，不同的对映体是通过选择性扩散或吸 附来完成跨膜过程的。
选择性扩散固膜一般都不带有特殊的手性拆分剂， 形成选择性扩散的原因是一种异构体比另一种异构体 在固膜中更容易扩散。
选择性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母体中的 手性拆分剂与对映体之间特殊的分子间作用来进行手 性拆分。通常一种异构体被较多的选择性吸附在手性 拆分剂上，而另一种异构体则较多的游离在聚合物母 体之中。
因此，研究互为对映体的手性物质的物理化学性质， 获得单一的对人体和环境有益的手性对映体单体，使得手 性分离分析技术的研究与发展显得十分必要。
12
第二节 手性物质分离分析的一般方法
13
1、手性源合成法 2、结晶拆分法 3、化学拆分法 4、酶拆分法 5、膜拆分法 6、萃取拆分法
手性分离方法的优化和分离效率提高策略
手性分离方法的优化和分离效率提高策略手性分离是一种重要的化学技术，在药物合成、农药研发、材料科学等领域中具有广泛的应用。
手性分离的目的是将混合物中的两种对映异构体分离开来，从而获取纯度较高的手性化合物。
然而，由于对映异构体的物理和化学性质的相似性，手性分离常常具有一定的难度。
因此，优化手性分离方法和提高分离效率成为迫切需要解决的问题。
一、使用手性分离剂手性分离剂是一种在手性分离过程中起作用的分子。
这些分子具有明显的手性结构，能够选择性地与其中一种对映异构体形成化学键。
通过与对映异构体形成复合物，可以实现分离和纯化的目的。
下面以手性分离剂佐剂为例，介绍其应用。
佐剂在手性分离中的应用已经被广泛研究。
在手性分离剂与对映异构体形成复合物的过程中，佐剂作为一种辅助剂，能够增加分离过程中的选择性和效率。
优化佐剂的选择和使用条件，可以提高手性分离的效果。
二、改进手性分离的操作条件手性分离的操作条件对于提高分离效率至关重要。
以下是一些改进操作条件的策略：1.温度调控：温度是影响手性分离效果的重要因素。
通过选择适宜的分离温度，可以调整物质在分离过程中的活性和选择性，提高分离效率。
2.溶剂选择：溶剂对于手性分离的效果有着显著影响。
选择合适的溶剂可以增加分离剂和对映异构体之间的相互作用，加快分离速率。
3.浓度调节：溶液中分离剂的浓度对于分离效果具有重要影响。
合理调节浓度可以达到最佳的分离效果。
4.反应时间：反应时间是控制手性分离的另一个关键因素。
通过合理控制反应时间，可以充分利用反应动力学的优势，提高分离效率。
三、进一步优化手性分离方法除了改进操作条件，进一步优化手性分离方法也是提高分离效率的重要策略。
以下是一些优化方法的介绍：1.色谱技术：色谱技术是手性分离的常用方法之一。
通过改变色谱柱材料、调节流动相成分和流速等因素，可以增加分离剂与对映异构体之间的相互作用，实现高效分离。
2.膜分离技术：膜分离技术是一种基于分子尺寸和手性识别的分离方法。
ChiralcelOJ—H手性色谱柱—HPLC法同时分离4种H1受体拮抗药的对映体
ChiralcelOJ—H手性色谱柱—HPLC法同时分离4种H1受体拮抗药的对映体目的：建立拆分盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏4种H1受体拮抗药对映体的方法。
方法：采用高效液相色谱法（HPLC），选择Chiralcel OJ-H手性色谱柱，检测波长为230 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL；以保留时间、选择因子和分离度为指标，考察流动相中酸碱添加剂（二乙胺）、有机改性剂的种类（乙醇、异丙醇）及其占比、甲醇等对4种药物对映体分离的影響。
结果：流动相考察结果为盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪的流动相为正己烷-乙醇（90 ∶10，V/V）；特非那定的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（89 ∶9.9 ∶ 1 ∶0.1，V/V/V/V）；马来酸非尼拉敏对映体的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（98 ∶ 2 ∶0.5 ∶0.1，V/V/V/V）。
在此条件下，4种药物的对映体均达到完全分离，分离度分别为4.36、3.76、1.55、1.71。
结论：建立的Chiralcel OJ-H手性色谱柱-HPLC法对这4种H1受体拮抗药的选择性良好，可用于其对映体的手性分离。
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a method for separating of 4 kinds of H1-receptor antagonist enantiomers as cetirizine hydrochloride，promethazine hydrochloride，terfenadine and pheniramine maleate. METHODS：HPLC method was adopted. Chiralcel OJ-H chiral column was selected. Detection wavelength was set at 230 nm；column temperature was room temperature；flow rate was 1.0 mL/min；sample size was 20 μL. Using retention time，selective factors and separation rate as indexes，the influence of acid-base additives （diethylamine），type and ratio of organic modifiers （ethanol，isopropanol），methanol on the separation of 4 kinds of enantiomers in mobile phase were investigated. RESULTS：The results of mobile phase investigation was the mobile phase of cetirizine hydrochloride and promethazine hydrochloride was n-hexane and ethanol （90 ∶10，V/V）. Mobile phase of terfenadine was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （89 ∶9.9 ∶ 1 ∶0.1，V/V/V/V）. Mobile phase of pheniramine maleate enantiomers was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （98 ∶ 2 ∶0.5 ∶0.1，V/V/V/V）. Under the condition，4 kinds of drug enantiomers were separated completely，with separate rate of 4.36，3.76，1.55，1.71. CONCLUSIONS：Established Chiralcel OJ-H chiral column-HPLC is selective for these 4 kinds of H1-receptor antagonists，and can be used for the chiral separation of the enationmers.KEYWORDS Chiralcel OJ-H chiral column；HPLC；H1-receptor antagonists；Cetirizine hydrochloride；Promethazine hydrochloride；Terfenazine；Pheniramine maleate；Enantiomer组胺是一种内源性的生物活性物质，可参与多种复杂的生理过程。
手性分析条件的建立和优化——手性分析中的注意事项完美幻灯片PPT
选择合适的手性柱
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分析条件优化流程图 （3）
3. 选择合适的手性柱
基线分离
分离？
没有分离
OK!
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部分分离
尝试别的手性柱
继续优化分析条件
筛选结果
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30
色谱条件
25
20
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流动相：
10
mV 6.66
7.52 mV
6.68.771 mV
4.46.882
65 60
AD 55 50 45 40 35 30 25 20 15
60
OD
55 50
45
40
35
30
25
20
15
OB
Hex./IPA/ AcOH = 5
10
10
5
5
90/10/0.1 0
0
0
-5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 150 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Minutes
Minutes
流量：1.0mi/min. 温度：25℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）
Hex/IPA=90/10
Hex/IPA/DEA=90/10/0.1
添加物的种类和用量
样品酸碱性 中性
碱性
添加物种类
不需要 乙二胺 (DEA)
(n-丁胺*1) (乙醇胺*2)
酸性
三氟乙酸 (TFA) 醋酸
*1 主要用于1级胺 *2 主要用于1级氨基醇
手性药物现代分析方法与技术培训课件
手性药物现代分析方法与技术
23
蛋白质手性固定相：
以离子键（或共价键）和蛋白交联作用将蛋白质固定于硅胶上， 利用蛋白质分子与手性化合物分子间的立体选择性作用，进行药物 对映体分离，其机理一般有氢键、静电作用、疏水作用、离子对和 离子交换等作用。
人α-酸性糖蛋白（ α-AGP）：多种类型药物 人血清白蛋白（HSA）：多种类型药物 牛血清白蛋白（BSA）：适于阴离子型手性化合物，如氨基酸及 其衍生物、芳香亚砜和香豆素类等 卵黏蛋白（OVM）：用于胺类和羧酸化合物的手性拆分 纤维素二糖水解酶（CBH）：适于分离多种类型的碱性药物。
连接在固定相上的手性识别剂，与药物对映体反应形成非对映体复 合物，然后作分离测定。分离的程度和洗脱顺序取决于复合物的相对强 度。
2.手性流动相法（CMP）
向流动相中加入一手性试剂，它与溶质常以氢键、离子键或金属离 子的配位键生成非对映体缔合物，从而以常规HPLC固定相分离。
3.手性检测器法（CD）
手性药物现代分析方法与技术
优点：容易制备，拆分选择性好，柱载量高，已有多种商品化柱 缺点：只适用于含有芳香基团的手性化合物的分离。
手性药物现代分析方法与技术
19
手性聚合物固定相
包括纤维素衍生物型、合成聚合物型，主要通过吸引和包合 作用实现对映异构体的拆分。可分离烃、酯、醇、酸、酮、酰 胺及含磷和硫化合物等。
流动相：烷烃-醇混合体系（正己烷-异丙醇）
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常用的手性添加剂：
手性离子对试剂
在HPLC流动相中加入反离子，使之与流动相中对映体生成 非对映的离子对复合物，由于这些离子对复合物具有不同的稳 定性和分配性质，在与固定相发生静电、疏水或氢键作用后， 产生差速迁移而得以分离。
氟环唑对映体绝对构型的确定及残留分析方法研究
氟环唑对映体绝对构型的确定及残留分析方法研究张春艳;刘志伟;苟高章;杨倩文;施海燕;王鸣华【摘要】采用Lux Cellulose-1手性柱,建立了氟环唑对映体的反相高效液相色谱拆分方法.采用高效液相CD检测器确定了氟环唑对映体的旋光性和流出顺序,通过比较实测圆二色光谱图与计算圆二色光谱图,确定了氟环唑对映体的绝对构型.在此基础上,建立了氟环唑对映体在蔬菜水果及土壤中的残留分析方法,系统评价了方法的精密度、准确度、灵敏度和基质效应.在优化条件下,即以乙腈-水(60:40,V/V)为流动相、流速0.6 mL/min、柱温30℃、检测波长220 nm,实现了氟环唑对映体的基线分离.手性柱上流出的第一个峰为(S,R)-(-)-氟环唑,第二个峰为(R,S)-(+)-氟环唑.在0.1～10.0 mg/L的浓度范围内线性关系良好,无明显基质效应.氟环唑对映体在6种基质中的平均回收率在80.8％～96.7％之间,日间相对标准偏差为1.5％～6.1％,日内相对标准偏差为1.1％～6.7％;方法的最小检出量(LOD)为0.10～0.15 ng,定量限(LOQ)为0.05 mg/kg.本方法能满足食品和环境样品中氟环唑对映体的检测要求.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2018(046)011【总页数】7页(P1778-1784)【关键词】氟环唑;对映体;高效液相色谱;绝对构型;残留分析【作者】张春艳;刘志伟;苟高章;杨倩文;施海燕;王鸣华【作者单位】南京农业大学植物保护学院,南京210095;南京农业大学植物保护学院,南京210095;红河学院理学院,蒙自661199;南京农业大学植物保护学院,南京210095;南京农业大学植物保护学院,南京210095;南京农业大学植物保护学院,南京210095【正文语种】中文1 引言随着手性技术的不断发展，手性农药已经成为手性技术发展过程中的一大亮点，国际市场中商品化的农药中有30%是手性农药[1～4]。
Lux手性色谱柱资料
H
O
H N
C
H
C
O
H
C Cl C l
H
对一组14种不同性质的外消旋体研究显示，有两种衍生固定相有 合理的选择性可以完全分离14种化合物，3-氯-4-甲基苯基氨基甲 2 酸酯就是其中一种。
纤维素骨架构成的直链形成 多种凹槽和孔穴，产生空间 及包合作用。
O
CH3 OH H N
Lux™ 5 μm Amylose-2 α = 1.41
1 2
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CH3
"QQ*%
200
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0
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2
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6
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min
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1000
0 0 2 4 6 8 min
氯苯那敏
CH3
mAU
"QQ*%
两柱条件： 规 格： 250 x 4.6 mm 流动相： 0.1 ％二乙胺的正己烷/ 0.1 ％二乙胺的异丙醇（ 60:40 ） 流 速： 1 mL/min 检测器： UV @ 220 nm 温 度： 室温
直链淀粉形成螺旋链， 通过不同的凹槽和孔穴 产生独特的空间作用。
氯原子拥有强电负性， 可产生偶极作用。
#F[IBO$IBOLWFUBE[F &JKJ:BTIJNB :PTIJP0LBNPUP +$ISPNBUPHSBQIZ"
压力稳定至300bar正相体系极性有机相体系sfc和反相体系下稳定提供3m和5m的色谱柱以及用于制备生产的20m散装填料lux纤维素三4甲基苯甲酸酯lux直链淀粉和纤维素csps手性固定相是互补的使您的手性筛选有更多的选择
阿替洛尔对映体的制备、活性以及手性分析方法简述
阿替洛尔对映体的制备、活性以及手性分析方法简述孙晶;王艳杰【摘要】综述了近年来手性药物阿替洛尔制备合成的方法及其药理活性、临床应用方面的研究进展,介绍了阿替洛尔手性分离的主要方法.【期刊名称】《生命科学仪器》【年(卷),期】2010(008)003【总页数】3页(P34-36)【关键词】阿替洛尔;对映体;手性分离【作者】孙晶;王艳杰【作者单位】曲靖医学高等专科学校公共课部化学教研室;曲靖医学高等专科学校临床系【正文语种】中文许多药物的两个对映体在药动学、药效学方面有显著差异。
某些情况下 ,其光学异构体产生的副作用难以预想。
因此解决提供光学纯化合物供药已成为近年来药物学、化学、生物等领域的热点课题。
本文简述了近年来阿替洛尔对映体的合成、药理活性以及利用色谱分离其对映体研究进展。
阿替洛尔(氨酰心安，Atenolol)，分子式为C14H22N2O3，化学名称为:4-[(3-异丙氨基-2-羟基)丙氧基苯乙酞胺4 -[2-hydroxy-3-[ 1 - methylethyl -amino]propoxy]benzeneacetamide，其结构式如下:阿替洛尔是一种新的β-肾上腺素能受体阻滞剂，有R-和S-构型对映异构体，其中S-阿替洛尔就其药理学活性来看，作为β-受体阻滞剂是非常有药效的。
1 制备合成有关阿替洛尔合成的报道很多，合成的条件也不断优化，但是合成大多为制剂均为S 和 R 对映体各半混合的外消旋体。
文献[1]以对羟基苯乙酰胺为起始原料先加环氧氯丙烷，再加氢氧化钠进行缩合；然后用水做溶媒进行胺化，提高了产物的的质量和收率。
合成线路如下：胥波[2]仍以对羟基苯乙酰胺为起始原料改进了阿替洛尔的合成，在环氧物和阿替洛尔的制备两个过程中注重反应环氧氯丙烷用量问题及反应的温度控制，并对合成阿替洛尔进行酸碱精制。
在李华英[3]的论文中也报道了多种阿替洛尔的合成方法，并在分析各种不同的合成机理的基础上设计并合成了(S)-阿替洛尔。
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Lux Cellulose-1
cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)
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H
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cellulose tris(4-methylbenzoate)
Chlorinated Cellulose Phase
Cellulose Ester Chiral Selector
Novel Chlorinated Cellulose Phase
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Normal Phase
Hexane:IPA 8:2* (Lux 5 μm Cellulose-1, Cellulose-2, Cellulose-3, Cellulose-4, and Amylose-2)
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Reversed Phas ase
Acidic Compounds 1. CH3CN:0.1 % Formic Acid or 0.1 % Acetic Acid 2. MeOH:0.1 % Formic Acid or 0.1 % Acetic Acid Neutral Compounds 1. CH3CN:Water 2. MeOH:Water Basic Compounds 1. CH3CN w. 20 mM NH4HCO3 + 0.1 % DEA 2. MeOH w. 20 mM NH4HCO3 + 0.1 % DEA
C
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Cellulos e B ackbone
Cellulose Backb one
Cel l ul ose Backbone
Cel l ul ose Backbone
A mylo s e Ba c k b o n e
Guaranteed Replacement For CHIRALCEL® OD-H®
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SIMPLIFIED CHIRAL SEPARA SEPARATIONS RATIONS
EASY CHIRAL METHOD DEVELOPMENT SOLUTIONS
Simplify Your Screening Strategy
®
With five unique Lux stationary phases to screen, achieving optimal chiral separation is easier than ever
*Can also use 0.1 % Formic Acid or 0.1% TFA
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Lux Cellulose-4
cellulose tris(4-chloro-3-methylphenylcarbamate)
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Lux Amylose-2
amylose tris(5-chloro-2-methylphenylcarbamate)
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Flush your column with ten column volumes of 100 % IPA at a flow rate of 0.2-0.4 mL/min
Polar Organic
Reversed Phase SFC
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SFC
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Solvent Switching
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Rs > 1.5 MeOH:IPA 9:1*◊
C02:MeOH with 0.1 % DEA* 75:25 (Lux 5 μm Cellulose-1, Cellulose-2, Cellulose-3, Cellulose-4, and Amylose-2) (tR > 20 min)
(tR < 20 min) (tR < 20 min) (tR > 20 min) No Separation (Rs=0) Rs < 1.5 Decrease % IPA but keep tR < 20 min Adjust % IPA to get tR < 20 min Try an alternative organic modifier
Rs > 1.5
Normal Phase
• Alkane/alcohol mixtures • Aqueous methanol/acetonitrile • Buffer and methanol/acetonitrile mixtures • Supercritical CO2
Normal Phase
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If modifier is < 5 %, try a different modifier at above starting conditions