不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究_随志刚
(药理药化(收稿日期:2008-10-09; 修订日期:2008-12-20基金项目:国家自然科学基金(N o .30873360);吉林省科技发展计划资助课题(No .20080105)作者简介:随志刚(1979-),男(汉族),吉林长春人,现为吉林大学药学院在读博士研究生,硕士学位,主要从事质谱分析化学研究工作.*通讯作者简介:刘忠英(1964-),女(汉族),吉林白城人,现任吉林大学药学院教授,博士生导师,博士学位,主要从事生物化学分析研究工作.草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究随志刚1,陈明玉1,刘志强2,皮子凤2,刘忠英1*(1.吉林大学药学院,吉林长春 130021; 2.中国科学院长春应用化学研究所,吉林长春 130022)摘要:目的优化草乌中乌头类生物碱提取方法,比较草乌、附子生品及市售炮制品中乌头类生物碱的含量,为相关中药中生物碱的测定和临床应用提供参考。
方法分别用7种提取方法提取附子中乌头类生物碱,比较各方法对3种双酯型生物碱的提取效率,并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量。
结果10%氨水乙醚冷浸法对3种双酯型生物碱的提取效率最高。
炮制品中的乌头类生物碱含量明显低于生药,各种炮制品中乌头类生物碱的含量差别也比较大。
结论采用10%氨水乙醚冷浸法,高效液相色谱-紫外光谱(H PLC-UV )法对药材中乌头类生物碱进行提取和含量测定,能真实反映药材中药效和毒性成分。
不同的炮制品中各生物碱含量差别较大,临床应用应有差别。
关键词:提取方法; 草乌; 附子; 乌头碱类生物碱中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2009)03-0513-02Co mparison of D ifferent Extraction M ethods of Aconitu m A lkaloids fro m Radix Aconiti Kus nezoff iiS U I Z h-i gang 1,C H EN Ming -yu 1,L I U Z h-i q iang 2,P I Z -i feng 2,L I U Z hong -y i n g1*(1.College of Phar m acology,J ilin Un i v ersit y ,Changchun 130021,China;2.Changchun Institute of App lied Che m istry ,Chinese Acade m y of Sciences ,Changchun 130022,China )Abst ract :O bjective T o optim ize the ex tracti on techno logy of acon itu m a l ka l o i ds from R adi x A con iti K usnezoff ii ,and to de ter -m i ne the contents o f acon it u m a l kalo i ds i n R ad i x A conitiK usnezoffii ,Fuzi and their processed produc ts so l d i n Ch i nese phar m acy .M ethods The effi c iency of seven ex tracti on m ethods w ere compared by deter m i n i ng the conten ts o f acon i tine ,m esacon iti ne and hypacon iti ne of sa m ples extracted by d ifferent m ethods .The H PLC -UV m ethod w as used to deter m i ne t he contents o f acon itu m a l ka l o i ds i n R ad i x A conitiK usnezoffii ,Fuzi and their processed products .Re s u lts The m ost e fficient me t hod was to ex tract sa m ple w it h e t her from the herb sub m erged i n 10%a mm onia .T he three diester-d iterpeno i d a l ka l o i ds o f processed products w ere m uch lo w er than t hose o f the raw herbs and the con tents o f acon it u m a l kalo i ds i n d iffe rent processed products we re different w i de l y .Conc l u sion The me t hods used i n ex tracti on and ana l ysis f o r acon itu m a l ka l o i ds from herbs are e ffecti v e ,reli able and si m ple .D i -f ferent k i nds o f processed products of ra w herbs shou l d be d i scri m i nati ng l y treated in cli nic applica ti on .K ey w ords :Ex tracti on m ethod ; R ad i x A coniti Kusnezoff ii ; Fuz;i A conitu m a l kalo i ds 在乌头类生药及炮制品中,生物碱成分既是药效成分同时也是毒性成分[1],而且稳定性不好,很容易降解[2],所以生物碱的提取方法在其成分分析中十分重要。
四川道地产区乌头药材不同部位6种生物碱含量对比研究
四川道地产区乌头药材不同部位6种生物碱含量对比研究摘要目的：研究四川道地产区6种乌头生物碱在不同部位的分布差异，比较母根、子根基于化学成分的区别。
方法：采用超高效液相色谱法（UPLC）测定19批四川道地乌头药材母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量，并结合SPSS 统计软件对数据进行显著性差异、聚类分析和主成分分析研究。
结果：6种乌头生物碱在3个部位的分布差异各不相同。
母根、子根中苯甲酰新乌头碱、新乌头碱含量有显著性差异，为两者的差异性指标成分。
聚类分析、主成分分析也将供试样品分成母根、子根两大类。
结论：母根、子根的物质基础有差别，可为临床正确使用提供参考。
关键词UPLC；乌头；母根；子根；乌头生物碱；区别1 材料1.1 仪器超高效液相色谱系统（ACQUITY UPLC，美国Waters公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower2工作站），电子天平（XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司），粉碎机（MF10，德国IKA 公司），高速冷冻离心机（ST16R，美国Thermo公司），平行溶剂蒸发仪（Q-101，瑞士BUICH公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
1.2 药品与试剂苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱（纯度和批号分别为99.6%，111795-200901；96.5%，111794-201102；99.5%，111796-200901；100%，110799-200505；100%，110720-200410；99.5%，110798-200805；均购于中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；醋酸铵（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）；碳酸氢铵（优级纯，天津市元力化工有限公司）；醋酸（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；异丙醇、醋酸乙酯（分析纯，天津市化学试剂二厂）；氨水（分析纯，天津市化学试剂三厂）；超纯水（Milli-Q制备）。
附子不同组织中生物碱含量的测定
Vol. 24 No. 1 M ar. 2009
附子不同组织中生物碱含量的测定
侯大斌 赵祥升 王 惠 许 源
(西南科技大学生命科学与工程学院 四川绵阳 621010)
摘要 :对附子不同组织中乌头总碱和 3种双酯型生物碱 —新乌头碱 、乌头碱和次乌头碱的含量进行了测定 。用酸性 染料比色法测定乌头类总生物碱的含量 ;反相高效液相色谱法测定新乌头碱 、乌头碱 、次乌头碱的含量 ,色谱柱为 : Zorbax extend - C18 (150 mm ×4. 6 mm , 5. 0μm ) ,流动相为乙腈 —0. 1%乙二胺 ,梯度洗脱 ,流速为 l mL /m in,检测波 长为 240 nm ,柱温 30 ℃。结果表明 :附子不同组织中生物碱的含量呈现明显的差异性 。子根 、茎秆 、叶 、须根和母 根中乌头类总生物碱含量分别为 : 5. 53, 3. 81, 14. 77, 8. 87和 4. 58 mg/ g; 3种双酯型生物碱含量在不同组织中的含 量顺序为 :须根 >子根 >母根 >叶片 >茎秆 。该研究可为附子资源的综合利用提供科学依据 。 关键词 :附子 新乌头碱 次乌头碱 乌头碱 高效液相色谱法 中图分类号 : R282; S567 文献标识码 : A 文章编号 : 1671 - 8755 (2009) 01 - 0098 - 04
不同海拔栽培附子的毒性指标和药效指标比较分析
不同海拔栽培附子的毒性指标和药效指标比较分析张美华1，谭奕为1，李伟强1，黄倩盈1，吴耿寰1，徐天才2*，（1广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁530001；2云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南丽江674100）摘要：为了解云南不同海拔栽培附子与道地产区出产附子的品质差异，以云南西北地区9个不同海拔栽培的附子为试材，以四川江油附子为对比样，参照《中华人民共和国药典》，采用高效液相色谱法（HPLC ）对附子样品中的3种毒性检测指标物（新乌头碱、次乌头碱、乌头碱）和3种药效检测指标物（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱）进行含量分析。
结果表明，云南9个高海拔试验田种植的附子毒性检测指标物含量明显低于四川江油对比样、药效检测指标物含量明显高于四川江油对比样；且在海拔为2169m 的云南迪庆藏族自治州维西县永春乡拖枝村等地，附子的毒性检测指标物含量较低，接近药典规定的毒性指标，药效检测指标物含量远高于药典规定的药效指标。
此发现，可为利用海拔优势推广种植高效低毒附子的栽培研究提供参考，为当地布局优势产业提供理论依据。
关键词：附子；海拔；生物碱；毒性检测指标；药效检测指标中图分类号：R286.0文献标志码：AComparative Analysis of Toxicity and Efficacy Indi ‐cators of Radix Aconiti Lateralis Preparata Culti ‐vated at Different AltitudesZHANG Meihua 1,TAN Yiwei 1,LI Weiqiang 1,HUANG Qianying 1,WU Genghuan 1,XU Tiancai 2*(1Guangxi Subtropical Crops Research Institute,Nanning,Guangxi 530001,China;2The Alpine Economic PlantResearch Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Lijiang,Yunnan 674100,China)Abstract:In order to understand differences in quality of Aconiti Lateralis Radix Preparata (Fuzi)cultivated at different altitudes in Yunnan Province and those produced in original areas,the Fuzi cultivated at 9different altitudes in northwest of Yunnan Province were used as the test materi ‐基金项目：云南省科学技术厅，三年行动计划“迪庆藏区附子良种筛选与优质高产栽培技术研究及示范”项目（2017DC013）。
附子中新乌头碱的含量测定
附子中新乌头碱的含量测定贾金艳，彭小冰，沈洲卿，杨卫平【摘要】目的成立以高效液相色谱法测定附子中新乌头碱含量的方式。
方式采纳Welchrom-C18 色谱柱(5 μm , mm×250 mm)，以甲醇－水－三乙胺（75∶25∶）为流动相，流速为 ml·min-1，检测波长为233 nm，柱温为30℃。
结果新乌头碱在 4～ 8 μg范围内呈良好线性关系，r= 9；平均回收率为%，RSD=%。
结论该方式操作简便、准确、重复性好，可用于附子中新乌头碱的含量测定。
【关键词】附子；新乌头碱；高效液相色谱法附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效［1］。
附子的要紧成份是乌头类生物碱，可分为单酯类、双酯类和胺基醇类生物碱。
其中以双酯型类生物碱如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱成份毒性较大，但又同时是附子的药性成份。
历代医家都超级重视附子的毒性及其用量［2］。
为保证用药的平安性，本文在参考有关文献的基础上［3，4］，对附子生品中的新乌头碱进行含量测定，希望能够为其在质量操纵方面提供必然的依据。
1 仪器与试药仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪,HS10260D超声洗洁器，XS205电子天平（十万分之一），JT1003电子天平（千分之一）。
试药新乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号： 110799－200404）；甲醇为色谱纯；三乙胺、乙醚为分析纯；盐酸；氨水；纯净水。
2 方式与结果色谱条件色谱柱： Welchrom-C18 (5 μm ， mm×250 mm)；流动相为甲醇-水-三乙胺（75∶25∶）；流速： ml·min-1；检测波长：233 nm；柱温：30℃。
进样量：5 μl。
在该色谱条件下，新乌头碱与杂峰分离良好。
结果见图1～ 2。
溶液的配制对照品溶液的制备周密称取新乌头碱对照品适量，配制成·ml-1的对照品溶液，再周密吸取此对照品溶液，，，，，，， ml别离定容于5 ml容量瓶中。
HPLC法测定不同产地附子中主要成分的含量
HPLC法测定不同产地附子中主要成分的含量目的考察不同产地的西南附子中新乌头原碱，次乌头原碱和乌头原碱的含量。
方法采用HPLC进行测定，色谱柱为Diamonsil C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为四氢呋喃-乙腈（15∶25）；流动相B为醋酸铵溶液（0.1 mol/L），检测波长λ=235 nm；流速1 ml/min；柱温25 ℃。
结果不同产地的西南附子样品中生物碱类成分的含量有着明显差异，新乌头碱的含量以贵州小河的最高为0.17%，贵州兴义的最低为0.06%；次乌头碱的含量以四川江油的最高为0.28%，贵州花江的最低为0.13%；乌头碱的含量以云南腾冲与贵州水口寺的最高为0.04%，四川江油与贵州龙里的最低为0.01%。
结论西南附子中三种乌头碱的总含量以四川江油和云南腾冲产者最高。
另外，HPLC测定法简单、易行，可为附子的产区扩大研究提供科学依据。
Abstract：Objective To investigate the content of new aconitine，sub aconitine and aconitine in Aconitum monkshood from different habitats.Methods The chromatographic column is determined by HPLC，the column is Diamonsil C18 column（150mm×4.6 mm，5μm），the mobile phase A is tetrahydrofuran acetonitrile （15：25），the mobile phase B is ammonium acetate solution（0.1mol/L），the detection wavelength is λ=235 nm，the velocity is 1 ml/min，and the column temperature is 25℃.Results The contents of alkaloids in the samples from different habitats were significantly different.The content of neoaconine was 0.17% in Guizhou Xiaohe and 0.06% in Guizhou Xingyi.The content of sanaconine was Sichuan Jiangyou.The highest was 0.28%，and the lowest in Guizhou Huajiang was 0.13%；the content of aconitine was 0.04% in Yunnan Tengchong and Guizhou Shuikou Temple，and the lowest in Sichuan Jiangyou and Guizhou Longli was 0.01%.Conclusion The total content of three aconitines in Aconite in the southwest is highest in Sichuan Jiangyou and Yunnan Tengchong.In addition，the HPLC assay is simple and easy to perform，which can provide scientific basis for the expansion of aconite production areas.Key words：Aconite；New aconitine；Subaconitine；Aconitine；HPLC附子为毛莨科植物乌头的子根的加工品。
中国药典收载附子3种加工品中生物碱的含量分级对比测定
《中国药典》收载附子3种加工品中生物碱的含量分级对比测定作者：余葱葱，彭成，郭力，叶强【摘要】目的系统对比研究盐附子、黑顺片、白附片3种附子加工品的生物碱含量。
方法采用常用滴定、UV、HPLC方法分别测定附子3种加工品的总生物碱，酯型生物碱，乌头碱、乌头次碱、新乌头碱等双酯型生物碱的含量。
结果盐附子同黑顺片、白附片相比，总生物碱含量下降80%～85%，酯型生物碱下降70%～85%，乌头碱等等双酯型生物碱下降90%以上，其中乌头碱下降92%以上。
结论在生物碱含量方面，盐附子与黑顺片、白附片有显著差异，后二者差异较小。
建议新版药典单列盐附子质量控制标准。
【关键词】分级对比加工品生物碱Abstract：ObjectiveTo research alkanoid contents in 3 kinds of prepared Radix Aconiti Lateralis Praeparata:salty Aconiti Root,black slice of Aconiti Root,white slice of Aconiti Root.MethodsNormal titration method,UV,HPLC were used to determine the total alkanoid,ester alkanoid,double ester alkanoid involved aconitine,hypaconitine,mesaaconition.ResultsCompared withblack slice of Aconiti Root and white slice of Aconiti Root,the total alkanoid declined 80%～85% ester alkanoid declined 70%～85%,double ester alkanoid declined over 90% in salty Acontit Root.ConclusionIn term of alkanoid, there is significant difference between Salty Aconiti Root and black slice of Aconiti Root,white slice of Aconiti Root.Black slice of Aconiti Root is similar with white slice of Aconiti Root in alkanoid content.It is recommended that salty Aconiti Root is unilined in new edition Chinese Pharmacopoeia.Key words：Radix Aconiti Lateralis Praeparata；Processing； Alkanoid附子Radix Aconiti Lateralis Preparata来源于毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx．的侧生子根及加工品。
附子不同部位及其炮制品生物碱的含量比较
生物碱 大小为 ： 附子皮＞ 生附子＞ 制 附子皮＞ 黑顺片＞ 白附片。结论 ： 附子 皮中生物碱 的含量高， 毒性 大， 为了保证其 临床有效性与
安全性 ， 黑 顺 片 与 白附 片 临床 应 用应 有 所 区分 。 关键 词 ： 附子 炮 制 品 酯 型 生物 碱 总 生 物碱 含 量 测 定
摘要 ： 目的 ： 比较 附子 不 同部 位 及 其 炮 制 品 生物 碱 含 量 变化 。 方 法 ： 采用 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ法 同 时测 定 附子 不 同部 位 及 其 炮 制 品 中 ６种 单 、 双酯型生物碱 的含量 ， 采用滴定法测定其总 生物碱含量 ， 分析其不 同部位及其 炮制 品生物碱含 量的变化。结果 ： 单酯型生物碱 大 小依 次 为 ： 制 附子 皮＞ 黑 顺 片＞ 白附片＞ 附子皮＞ 生 附子 ， 双 酯 型 生 物 碱 大 小为 ： 附子 皮＞ 生附子＞ 制 附子 皮 ＞ 黑 顺 片＞ 白附片． 总
ｏ ｆ Ｔ ＣＭ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ， ５ １ ０ １ ２ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ； ２ ． Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ，
不同剂量附子单煎乌头类生物碱煎出量分析
不同剂量附子单煎乌头类生物碱煎出量分析李学林;吴红展;许真【摘要】目的:考察附子在汤剂中不同质量分数时指标性成分的含量煎出规律,为临床使用附子时合理选择剂量提供依据.方法:采用RP-HPLC法,色谱柱为AgiLent C18 SB-Aq柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1 moL/L醋酸铵溶液、流速0.4～0.6 mL/min,检测波长235 nm,柱温30℃.结果:随着质量分数的增加,附子单煎水煎液中苯甲酰类乌头生物碱煎出增长率逐渐降低;单位质量药材中苯甲酰类乌头生物碱煎出量随附子用量增加呈降低趋势.结论:附子中苯甲酰生物碱的煎出率与附子的剂量有密切关系;随着剂量的增加,单味煎出量渐渐变小,而在达到100 g 之后较为明显,而附子毒性成分煎出量随着用量的增加其增长值渐渐趋于平缓;因此,在临床使用附子时应正确辨证,合理使用.【期刊名称】《中医研究》【年(卷),期】2016(029)005【总页数】4页(P70-73)【关键词】附子;剂量;乌头生物碱;含量测定【作者】李学林;吴红展;许真【作者单位】河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;郑州大学第二附属医院,河南郑州450014【正文语种】中文【中图分类】R284附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，主产于四川、陕西等地。
生物碱类成分是附子的主要有效成分和毒性成分，包括双酯型、单酯型、氨醇型和其他种类生物碱。
其中双酯型生物碱如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等既是主要的有效成分，又是毒性成分。
现代研究证实口服乌头碱0.2 mg即发生不良反应，口服3～4 mg即可导致死亡[1]。
有关附子临床应用的不良反应常被报道。
本研究探究了不同剂量附子在加水量一定时，其水煎液中乌头类生物碱质量分数的变化规律，为临床安全、合理使用附子提供依据。
新乌头碱、乌头碱与次乌头碱在附子不同炮制法中含量变化的实验研究
新乌头碱、乌头碱与次乌头碱在附子不同炮制法中含量变化的实验研究目的探讨不同炮制方法的炮制品中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱含量变化。
方法分别采用江西建昌帮法、樟树帮法与《中国药典》2005年版法制备附子炮制品，通过HPLC色谱法测定其中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱含量。
结果3种炮制方法的炮制品中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱的平均质量分数分别为：建昌帮法：（2.13±0.26），（6.78±0.18），（11.26±0.97）μg/g；樟树帮法：（2.35±0.39），（3.23±0.88），（8.09±0.92）μg/g；中国药典法：（1.43±0.18），0，（1.68±0.23）μg/g。
结论建昌帮煨制附子中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱总含量比另外两种方法的总含量要高，这为建昌帮炮制技术的研究提供了科学根据。
标签：炮制；附子；生物碱附子是临床常用的急救类中药材，性味辛、甘、大热，有毒，功能为回阳救逆、补火助阳、散寒止痛，具有“回阳救逆第一品药”之称[1]，药物分类学中属于毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品，临床上多用其炮制后的产品。
因为附子的炮制方法有很多种，加工工艺也各有不同，形成了附子饮片质量参差不齐的现象，临床应用的安全性与有效性得不到保证。
为了研究不同附子炮制方法对双酯型生物碱含量的影响，笔者应用建昌帮法、樟树帮法与《中国药典》2005年版方法炮制附子并进行比较，现报道如下：1 仪器与试药1.1 实验仪器色谱仪采用日本岛津生产的LC高效系列液相仪，分光计采用日立的T系列紫外可见光光度计，色谱数据参考浙江大学色谱数据库。
1.2 实验材料附子原料购自安徽金种子中药材发展责任公司，经我院药剂科袁如柏（主管中药师）鉴定为毛莨科植物乌头的子根加工品；对照品为新乌头碱、乌头碱与次乌头碱，均为中国药品生物制品检定所购入，纯度均为分析纯级别。
反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量（精）
反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量（精）反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量作者：邓雅琼，刘荣华，邵峰，卢锋【摘要】目的测定附子中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量。
方法采用反相高效液相色谱（PR-HPLC）法，使用UltimateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值为7.29）；检测波长：230 nm；流速1.作者：邓雅琼，刘荣华，邵峰，卢锋【摘要】目的测定附子中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量。
方法采用反相高效液相色谱（PR-HPLC）法，使用UltimateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值为7.29）；检测波长：230 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温为35℃。
结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为：Y=31.258X+5.794，r=0.999 9；Y=17.418X+5.236 9，r=0.999 8；Y=18.989X+6.186 6，r=0.999 7。
三者的线性范围分别为：3.3125～106μg/ml；0.735 7～23.541 9μg/ml；1.966 1～62.916 4μg/ml。
结论该方法简便、准确、分离效果好、灵敏度高,可用于附子的质量控制。
【关键词】附子反相高效液相色谱乌头碱新乌头碱次乌头碱Abstract：ObjectiveTo develop a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of three principal alkaloids in aconite root. Methods（4.6mm×250mm, 5μm）column by isocratic elution using Acetonitrile -0.2%Glacial acetic acid （adjusted to pH 7.29 with concentrated ammonia）.ResultsThe average recovery of the three alkaloids were analyzed simultaneously with UltimateTM XB-C18 ratesobtained were in the range of 98.93-100.5%for RSD below 2.0%.The linear ranges of aconitine; hypaconitine; mesaconitine were respectively 3.312 5～106 μg/ml, 0.7357～23.5419 μg/ml,1.9661～62.9164μg/ml (r=0.999 9, r=0.999 8, r=0.9997).ConclusionThe contents of alkaloids in aconite root varied significantly from species; hence quality control of aconite root is very necessary.Key words：Aconite root; RP-HPLC; Aconitine; Hypaconitine; Mesaconitine附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品［1］。
参附注射液中3种痕量成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的测定
参附注射液中3种痕量成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的测定该文建立了参附注射液中3种痕量附子指标成分的含量测定方法，为评价君药附子的药效学作用提供了依据。
样品经中空纤维液相微萃取（HF，LPME）进行纯化富集，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相乙腈，10 mmol·L-1碳酸氢铵溶液（pH 10），流速0.45 mL·min-1，梯度洗脱。
电喷雾电离（ESI）、多反应监测（MRM）方式进行含量测定。
结果表明，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在0.1～100 ng·L-1线性关系良好，r>0.999，检测限分别为0.03，0.03，0.02 ng·L-1，平均加样回收率分别为100.1%，97.4%，97.5%，RSD分别为1.2%，1.1%，1.5%。
该方法保证了参附注射液的用药安全，为正确评价附子的君药药效学作用提供了科学依据，为含有附子的中药制剂的质量控制提供了可靠方便而实用的检测手段。
标签：乌头碱；次乌头碱；新乌头碱；参附注射液；中空纤维液相微萃取；超高效液相色谱质谱参附注射液源于古方“参附汤”，是以红参、附子为主要成分的中药注射液，具有回阳救逆、益气固脱的作用。
临床上主要用于治疗心源性休克和心力衰竭。
处方中，附子作为君药，其主要活性成分为乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等双酯型生物碱，现代药理学研究证实，这类生物碱具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗肿瘤等作用[1，2]，对心血管系统具有强心、降血压、扩血管等作用[3]。
但同时这类生物碱的毒性较强，主要损害循环系统及中枢神经系统，引起机体多脏器功能的损害[4]。
参附注射液在生产过程中，除对附子药材的炮制处理有严格的要求外，还需通过特有的水解转化等工艺降低其毒性[5]，保证用药安全。
所以，制剂质量标准及研究文献中研究人员都试图对附子中双酯型生物碱含量进行严格的控制[6，7]。
HPLC法测定不同制法的四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量-文档资料
HPLC法测定不同制法的四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量四逆汤出自《伤寒论》，由附子、干姜、炙甘草组成，用于阳虚欲脱，冷汗自出，四肢厥逆，下利清谷，脉微欲绝等证。
近年来研究发现四逆汤具有很好的抗心肌缺血、再灌注损伤及保护心肌的作用[1～3]。
炮制后的附子中单酯型生物碱是四逆汤抗心肌缺血的关键有效成分[4]，主要包括苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等，干姜中的6-姜酚也是四逆汤重要有效成分之一，具有改善心肌舒缩性能，缓解心衰症状作用[5]。
本实验采用HPLC法测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚的含量，比较传统水提法、药典收录的水提醇沉法及有效部位组合法制备的四逆汤中以上4种有效成分的含量差异，对四逆汤提取工艺的改进提供参考依据。
1 仪器与试药Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，四元泵、自动进样器、恒温箱、DAD检测器，Chem Station 色谱工作站）； Mettler AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-250E 型医用超声波清洗器（群山市超声仪器XX公司）；恒温振荡器（国华仪器XX公司）；RE-52C旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。
药材黑附子、甘草、干姜均购于山东济南建联中药店，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为黑附子（毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.）的子根炮制加工品、干姜（姜科植物姜Zingiber officinale Rose.）的干燥根茎、甘草（豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的炮制加工品；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚对照品（供含量测定用，成都瑞芬思生物科技XX公司，批号分别为RFS-B-100713、RFS-B-110305、RFS-B-110328、A0218，含量均> 98%）；色谱用水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇、乙醇、醋酸铵、异丙醇、二氯甲烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
川乌、草乌、附子及其复方制剂中乌头类生物碱的含量测定研究概况
川乌、草乌、附子及其复方制剂中乌头类生物碱的含量测定研究概况提要综述了近年来国内外川乌、草乌、附子及其复方制剂中乌头类生物碱含量测定研究概况。
川乌、草乌、附子及其炮制品均为中国药典1995年版一部收载的常用中药。
中医认为这些药具有祛风除湿、温经止痛的作用。
现代药理研究证明，乌头类中药具有镇静、镇痛、强心、抗炎、抗肿瘤等作用。
由于其主要有效成分为剧毒的双酯型生物碱，而且治疗量与中毒量接近。
为确保临床用药安全有效，国内外学者在乌头类生物碱的含量测定方面做了大量工作。
1 分光光度法1.1酸性染料比色法赵玉梅等［1］选择溴麝香草酚蓝作为酸性染料，比色法测定骨痹痛散中乌头总生物碱含量，以乌头碱(12.06mg/50ml，0.05mol/L H2SO4)作对照，提取液于波长412nm处测定吸光度并计算出乌头总碱含量。
平均回收率为97.54%。
乌兰娜日等［2］选择溴甲酚绿为酸性染料，以乌头碱(10mg/100ml，氯仿)作对照，于波长(415±1)nm处测定附子理中丸中乌头总碱含量。
平均回收率为99.5%，RSD为1.43%。
王海孙等［3］选择文献［2］的条件测定风湿骨痛酒中乌头总生物碱含量，平均回收率为98.58%，RSD为1.83%，因处方中有麻黄，所以提取液在水浴上挥去溶剂后应在105℃烘1h以使麻黄碱挥发，排除干扰。
陶建生等［4］选择溴甲酚绿为酸性染料，以乌头碱做对照于波长416nm，处测定止痛酊中乌头总碱含量。
平均回收率为96.9%，RSD为3.0%。
杨云［5］以溴麝香草酚蓝为酸性染料，波长408nm处测定附子理中口服液中乌头总生物碱含量，平均回收率96.79%。
1.2 一阶导数分光光度法龙沛霞等［6］采用一阶导数光谱法测定制川乌、制草乌及附子中乌头生物碱含量。
测得结果与中国药典(1995年版)方法的测定结果比较无显著差异，而该方法操作起来更简便。
1.3 二阶导数分光光度法徐思文［7］采用二阶导数光谱法测定三七伤药片中总生物碱含量，样品和标准品溶液在波长(238±2)nm和(246±2)nm处有相应的吸收谷和吸收峰，而阴性对照光谱呈近平行线，不干扰样品中乌头总生物碱的定量分析。
《中国药典》收载附子3种加工品中生物碱的含量分级对比测定
（ ． 都 中医药大 学 ， １成 四川 成都 ６０ ７ ； ２ 四川省 中医药科 学 院附属 医院 ， １０ ５ ． 四川 成都 ６０４ ） １０ １
摘要 ： 目的 系统对比研究盐附子、 黑顺片、 白附片３ 种附子加工品的生物碱含量。方法 采用常用滴定、ｖ Ｈ Ｌ ｕ 、 Ｐ Ｃ方法
时珍国医国药 ２ １ ０ ０年第 ２ 卷第 ２ １ 期
ＬＳ ＩＨ ＮＭ ＤＣＮ Ｎ Ａ Ｅ Ｉ Ｅ ＩＡＲ ＳＡ Ｃ ００ Ｏ ．１Ｎ ． Ｉ Ｚ Ｅ Ｅ ＩＩＥＡ ＤＭ Ｔ ＲＡＭ ＤＣ Ｅ Ｅ Ｒ Ｈ２１Ｖ Ｌ２ Ｏ ２ Ｈ
《 中国药典》 收载 附子 ３种加 工品中 生物碱 的含 量分 级对 比测 定
Ｙ ｏ ｇｃ ｎ ，Ｅ Ｇ Ｃ ｅ ｇ ， Ｕ ｉ ， Ｅ Ｑ ａ ｇ Ｕ Ｃ ｎ －ｏ ｇ Ｐ Ｎ ｈ ｎ Ｇ ＯＬ Ｙ ｉｎ
（ ． ｈｎ ｄ ｎｖｒｔ ｏ Ｃ Ｃ ｅｇ ｕ６ ０ ７ ， ｈｎ ； ．ｆ ｌ ｔ ｏ ｉ ｌｏ ｉ ｕ ｎＩｓｔｔ ｏ Ｃ １ Ｃ ｅｇ ｕ Ｕ ｉ ｓ） ｆ Ｔ Ｍ， ｈｎ ｄ １０ ５ Ｃ ｉａ ２ Ａ ｉ ｅ Ｈ ｓ ｔ Ｓ ｈ ａ ｎｔｕ Ｔ Ｍ， ｅ ｉ ｉ ｆ ａ ｄ ｐａ ｆ ｃ ｉ ｅｆ
建议新版药典单 列盐附子质量控 制标准。
关键 词 ： 分献标 识码 ： Ａ
文章 编号 ：０ ８０ ０ （０ ０ ０ － ６ －２ １０ －８ ５ ２ １ ） ２ ２ ２ ０ ０
Ａｌ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｔｏ ｉ ｎｄ ｆ Ｐｒ ｐａ ｅ ｄ ｘ Ａｃ ｎ ｔ Ｌａ ｅ ａ ｉ ａｅ ｒ ｔ Ｃｏ － ｋａ ｏ ｄ Ｄｅ ｅ ｍ ｎａ ｉ ｎ ｎ ３ Ｋｉ ｓ ｏ ｅ ｒ ｄ Ｒａ ｉ ｏ ｉｉ ｔｒ ｌ Ｐｒ ｐａ ａ ａ ｓ ｌ ｌｃ ｅ ｎ Ｃｈ ｎ ｓ ｅ ｔ ｄ ｉ ｉ ｅ ｅ Ｐｈａ ｍａ ｏ ｅ ａ ｂ ａ ｓｃ ｔｏ Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ Ｍ ｅ ｈｏ ｒ ｃ ｐｏ ｉ ｙ Ｃｌ ｓ ｉａ ｉ ｎ－ ｍ ａ ｉｏ ｔ ｄ
不同产地附子含量测定
1.测定条件的选择
1.1对照品溶液的制备
精密称取经105℃干燥至恒重的乌头碱对照品2.96 mg，置25ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含乌头碱0.1184 mg）。
1.2最大吸收峰的确定
用下述条件对供试品液及对照品液与溴甲酚绿形成的离子对的氯仿溶液，在紫外分光光度计上从340-520 nm的范围内扫描，其最大吸收峰位在415 nm，与文献报道[1-2]相同。
仪器校正用的标准缓冲液的配制：
磷酸盐标准缓冲液：精密称取在115℃±5℃干燥2~3小时的无水磷酸氢二钠3.55 g与磷酸二氢钾3.40 g，加水使溶解并稀释至1000 ml。
硼砂标准缓冲液：精密称取硼砂3.81 g（注意避免风化），加水使溶解并稀释至1000 ml，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空气中二氧化碳进入。
0.365
2.3重复性实验
称取同一批号的药材粉末(附子1号)1 g，精密称定，按供试品溶液制备项下操作制备供试品，测定吸光度，平行制备6份。结果见表4。
表4重复性实验结果(n=6)
Table.4 Experiment results of repeatability (n=6)
样品号
取样量/g
吸光度
硫酸（广州化学试剂厂，批号：20070712-1）
乙醚（天津市百世化工有限公司，批号：20091101）
醋酸钠（天津市百世化工有限公司，批号：20100503）
冰醋酸（天津市百世化工有限公司，批号：20090320）
硼砂（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20090828）
磷酸氢二钠（天津市百世化工有限公司，批号：20090620）
含量/%
1
有毒中药现代药理研究之附子
附子[基原]本品为毛其科乌头屑植物乌头Af。
nj6Mmf“rMifAd?jj Debn的子根加工品。
[化学成分]含多种生物碱，总含量为o．32％，主要为海帕乌头碱(次乌头碱，hypa凹n心ne，C：：H d sol。
N)约0．048％、乌头碱(aconNne，CM HM0ll N)0．01％、新乌头碱(meeacont —tine，CMHM01，H)0．006％，其次有塔拉地萨敏(tal饥t2amine，C：d H：，OsN)、川乌头碱甲(chuanwu base，C2：HMO。
N)、J1[乌头碱乙(chuanwu b69e B．CMHM0‘N)、尼奥灵(neo —1ine)、宋果灵(son80rine)、附子灵(fuz山ne)、北乌碱(beiw山tne)、单乙酰塔拉胺(mono—acctytalatisamtne)、乌头生布碱A、B(senbusine A，B)、去甲猪毛菜碱(sals01inot)、棍掌碱(cogyneine)、借碱(18narine)、禾布碱(hokbusiMe)A，D、杰沙乌头碱(jesaconitiRe)、苯甲酰乌头原碱(ben加1aconine)、苯甲酰乌头原碱(benz。
ylme：acon5ne)、苯甲酰下乌头碱(ben301hypaconine)[1d。
从日本产附于中分离出消旋去甲乌药碱(d1—demethylcoclaMrtne，N8enamine)和棍*碱(c。
rynetne)，前者为水涪性强心有效成分，后者早期呈明显升压作用。
所含去甲猪毛菜碱也为水镕性强心成分。
四川江油一带产附子生物碱含量一船在I．1％一1．3％，而自四川江彰移栽于南京的附子中含总生物碱约o．77％，主要为新乌头碱(mesaconitine)约o．4％，另有海帕乌头碱，微量的川乌头碱甲及乌头碱，从附子中还分离到4种鸟头聚糖A、B、C、D(acon地n A，B，CPD)．水涪性成分尿喀咬，以及消旋去甲乌药碱(ht6enamLne)。
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不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
2006-11-26
基础医学论文
不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较目的考察不同采收时间的附子中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量。
方法采用高效液相色谱法进行测定，色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相A:乙腈-四氢呋喃（25:15）；流动相B:0.1mol/L醋酸铵溶液，检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃。
结果不同采收时期附子中三种乌头碱的含量发生了明显变化，随着时间（7 —— 9月份）的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势。
结论此方法简单、易行，可为附子的进一步研究提供科学依据。
附子；新乌头碱；次乌头碱；乌头碱；高效液相色谱法 [Abstract] Objective To study the content mensuration of Hypaconitine,Mesaconitin and Aconitine of Aconite root in different period of harvest.Methods The Diamonsil C18 column （150mm×4.6mm,5μm） was used,and mobile phase was composed of CH3CN - C4H8O （25:15）and 0.1 mol/L of ammonium acetate solution,detection wavelength was at 235 nm; the flow rate was 1.0ml/min;column temperature was at 25℃。
Results The content mensuration of three types of aconitine of aconite root in different period of harvest has chenged apparently,the content of hypaconitine appears to be decline tendency,instead,the content of mesaconitin and aconitine is ascent tendency from July to September.Conclusion This method is not only easy
but also practical,it could be the evidence of further research of aconite root. [Key words] Aconite root; Hypaconitine;Mesaconitin;Aconitine;HPLC 附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，为回阳救逆之要药[1].常用于大汗亡阳，吐泻厥逆，肢冷脉微，心腹冷痛，风寒湿痹，阳痿，宫冷，阳虚外感，阴疽疮疡以及一切沉寒痼冷之疾。
现代研究表明，附子的主要化学成分除乌头类生物碱外，还有醇胺、脂类及多糖等。
乌头碱是附子的有效成分同时也是毒性成分[2].为保证用药的安全有效，本文以附子为对象，以新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量为指标进行研究，比较不同采收期三种生物碱的含量差异。
进而为附子质量评价和临床应用提供借鉴。
1 仪器与试药 1.1 仪器 Aglient 1100高效液相色谱仪（自动进样器，四元泵，DAD检测器），HP1100/ WIND3D化学工作站；超声波清洗机（北京创新德超声电子研究所）；AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.
2 试药新乌头碱（批号：110799-200404,供含量测定用），次乌头碱（批号：110798-200404,供含量测定用），乌头碱（批号：0720-9807,供含量测定用），均购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为乐百氏纯净水；其他试剂均为分析纯。
1.
3 药材附子药材均采自贵州龙里，经贵阳中医学院药学系贺祝英教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichahli Debx.的子根。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相A:乙腈-四氢呋喃（25:15）；流动相B:0.1mol/l醋酸铵溶液；洗脱程序见表1;检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃；进样量10μl[3].表1 洗脱程序 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备取新乌头碱、次乌头碱和乌头碱对照品适量，置25ml容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液制成浓度为（新乌头碱0.2820mg/ml,次乌头碱0.2817mg/ml,乌头碱0.0802mg/ml）的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）约2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml,精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液50ml,称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得[3]. 2.2.3 阴性样品溶液的制备按上述供试品溶液的制备方法，制备不含附子的阴性样品溶液。
2.3 系统适用性试验分别取混合对照品溶液、供试品溶
液及其阴性溶液各10μl,按“2.1”项下色谱条件进样。
结果：阴性样品在新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰位置对应处无干扰峰出现。
样品中三种乌头碱与其他成分完全分离，且分离度大于1.5.见图1.A阴性对照品；B混合对照品；C样品；1新乌头碱；2次乌头碱；3乌头碱图1 三种溶液高效液色谱图 2.4 线性关系考察精密吸取混合对照品2、4、8、10、16、18μl,按“2.1”项下色谱条件进样。
以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得新乌头碱回归方程为：Y=1225.9X+39.463,R2=0.9989;在0.56——5.08μg 范围内呈良好线性关系。
次乌头碱回归方程为Y=1301.5X+18.581,R2=0.9996;在0.56——5.07μg范围内呈良好线性关系。
乌头碱回归方程为1011.4X+46.369,R2=0.9989;在0.08——1.44μg范围内呈良好线性关系。
2.5 精密度试验取“2.2”项下的对照品溶液10μl,按“2.1”项下色谱条件进样，重复测定6次。
新乌头碱峰面积的RSD=0.51%;次乌头碱峰面积的RSD=0.76%;乌头碱峰面积的RSD=1.71%.结果表明，仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12h进样，记录其峰面积。
新乌头碱峰面积的RSD=1.55%,次乌头碱峰面积的RSD=1.08%,乌头碱峰面积的RSD=2.95%,结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.7 重复性试验按“2.3”项下的方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。
新乌头碱含量的.RSD=2.05%,次乌头碱含量的RSD=1.34%,乌头碱含量的RSD=2.98%.结果表明此方法重复性良好。
2.8 加样回收试验称取同一附子样品1.00g（精密称定），共9份。
分别按高中低三个量加入新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的对照品，按“2.3”项下的方法，制备供试品溶液。
按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的平均回收率分别为98.61%、97.52%、97.41% ;RSD分别为1.71%,1.64%、1.89%. 2.9 样品含量测定精密称取不同采收时间的附子样品，按供试品溶液制备方法分别制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量。
结果见表2.表2 附子样品含量测定 3 结果分析测定结果表明，同一采收时间的附子中次乌头碱的含量最高，新乌头碱次之，乌头碱最低；不同采收时间的附子，随着时间（7 —— 9月份）的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势；三种生物碱的含量之和随采收时间呈上升趋势。
然而不能单凭含量来确定附子的最佳采收期，因为附子的有效成分恰是其毒性成分，用得妙可救人于危难，反之可害人于顷刻之间。
为了科学合理地采收和利用附子资源，确保临床用药的安全有效，还应与附子的毒性及临床疗效结合起来，综合分析，方能全面系统地评价“最有用亦最难用”的中药附子，本实验可为附子的进一步研究提供科学依据。
1 黄兆胜。
中药学。
北京：人民卫生出版社，2002:225. 2 张智琳。
浅析四逆汤类方治疗心力衰竭的特点。
中华中医药杂志，2005,2（4）：225-227. 3 国家药典委员会。
中国药典，Ⅰ部。
北京：化学工业出版社，2010:178.。