超氧阴离子含量测定

植物体内超氧阴离子自由基含量的测定
一、原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（⋅-2O ）。

利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。

超氧阴离子自由基与羟胺反应生成NO 2－， 在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺（红色）。

该红色产物在530nm 波长处有专一吸收峰。

根据NO 2－显色反应的标准曲线将样品测得的A 530换算成定NO 2－的浓度，再根据反应式直接进行超氧阴离子化学计算，得出超氧阴离子浓度。

反应式如下： NH 2OH + 2⋅-2O ＋ H ＋ → NO 2－＋ H 2O 2 ＋ H 2O 三、材料及仪器设备
1. 材料：小白菜。

2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。

四、实验步骤 1、标准曲线制备
标准液稀释100倍后，按上述表格顺序添加试剂，每一种试剂摇匀。

然后至于30℃培养箱中保温30分钟，显色反应后测定A530，以 NO 2－为横坐标，A530为纵坐标，绘制标准曲线。

2、超氧阴离子制备
称取1g 样品放入冰浴的研钵中，加入少量PBS （pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，定容10ml ，在8000r/min ，4℃下离心10min ，取上清液备用。

3、超氧阴离子的测定 －
25℃保温20min
－
上述反应液（ml） 2.0
对氨基苯磺酸（ml） 2.0
α－萘胺（ml） 2.0
30℃恒温箱中保温30min
4、含量计算
从标准曲线中计算出测定液对应NO2－的浓度，并换算成超氧阴离子的浓度(X)，再算出超氧阴离子的含量。

超氧阴离子的含量（μg-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V s
V t为样品提取液总体积；n为稀释倍数；V s为显色时取样品体积；X为从标准曲线上计算出的浓度。

五、实验结果
5.1 标准曲线
y = 19.025x
R2 = 0.97314
5.2 样品测定
样品A530=0.046
NO2－的浓度=0.046/19.025=0.0024ug/ml
超氧阴离子的含量（μg·g-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V s=2*0.0024*10*6/(1*2)=0.144 六、注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等
体积乙醚提取叶绿素。