超氧阴离子含量测定
超氧阴离子产生速率测定
超氧阴离子产生速率测定羟氨氧化法(王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。
很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·¯、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。
膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。
二、材料、仪器设备与试剂(一)材料植物叶片、花瓣等器官(二)仪器设备低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架(三)试剂(1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的N a2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH)(2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷)(3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500m L，(冷，磁)(4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全)三、试验步骤(1)制做亚硝酸根标准曲线2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线(2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨(3)研磨物以12000r/min离心15min，取上清液0.5mL加入0.5mL磷酸缓冲液和1mL10mmol·L-1盐酸羟胺，25℃静置1h(4)加入1mL17m mol·L-1对氨基苯磺酸和1mL7m mol·L-1α-萘胺，25℃静置20min，测其530处O D值四、计算根据测得的OD值，查标准曲线将花瓣中氧自由基含量的OD值转换成[NO2－]，依据羟胺与O2－的反应式：NH2OH+2O2－+H+→NO2－+H2O2+H2O从[NO2－]对[O2－]进行化学计算，将[NO2－]乘以2得到[O2－]。
超氧阴离子测定原理
超氧阴离子测定原理
超氧阴离子测定原理是通过测定样品中超氧阴离子（O2-）的
产生和消耗，来确定样品中的抗氧化能力。
超氧阴离子是一种自由基，它的产生和消耗与细胞的氧化还原状态密切相关。
超氧阴离子的产生一般是通过酶类反应催化。
细胞内存在着一种酶叫做超氧化物还原酶（SOD），它能够催化将超氧脂质
氧化产生的超氧阴离子转化成氧气和过氧阴离子。
因此，测定超氧阴离子的产生可以通过测定酶的活性来间接反映。
超氧阴离子的消耗与抗氧化物质的存在有关，比如抗氧化酶（如谷胱甘肽过氧化物酶-2，GPx-2）和抗氧化剂（如维生素
C和维生素E）等，它们能够催化将超氧阴离子转化成稳定的
产物，从而消除了超氧阴离子的毒性。
因此，测定超氧阴离子的消耗可以通过测定抗氧化物质的含量来间接反映。
超氧阴离子的测定方法有很多种，比如化学法、电化学法和光谱法等。
其中，化学法是通过与特定染料反应产生显色反应来测定超氧阴离子的含量，电化学法是利用电化学传感器对超氧阴离子进行直接测定，光谱法是通过超氧阴离子与特定荧光染料反应产生荧光信号来进行测定。
这些方法各有优缺点，可以根据实际需要选择合适的测定方法。
总之，超氧阴离子测定原理是基于超氧阴离子的产生和消耗来确定样品的抗氧化能力，通过测定酶活性或抗氧化物质的含量，来间接反映超氧阴离子的含量。
不同的测定方法可以选择不同的原理，但都可以用于评估样品的抗氧化能力。
超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-5053
2超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-5053规格：50T/48S可见分光光度法产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体3mL×1瓶2-8℃保存试剂二粉剂×2瓶2-8℃保存试剂三液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂五液体15mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前每瓶加6mL 蒸馏水充分溶解。
2-8℃保存4周。
产品说明：生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。
AP-TEMED 系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO －与对氨基苯磺酰胺和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm 处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm 的吸光值呈负相关。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照组织质量（g ）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置于冰上待测。
2、液体：直接检测。
若有浑浊则离心后取上清待测。
3、细胞样本：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每500万细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细胞（功率200w ，超声3s ，间隔10s ，重复30次），然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置冰上待测。
胞内羟基自由基和超氧阴离子自由基测定
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。
目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。
其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。
细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。
然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。
此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。
因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。
胞内羟基自由基测定机理：2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。
这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。
尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。
因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。
此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。
胞内羟基自由基测定方法：在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。
用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。
胞内超氧阴离子自由基测定机理：一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。
DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。
根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。
植物生理学中各项生理指标的测定方法
一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
超氧实验报告(植物超氧阴离子自由基含量的测定)
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为超氧阴离子自由基（O2－）。
O2－既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（1 O2）等。
·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。
本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。
二、实验原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。
O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。
取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值换算成NO2－的浓度，再根据反应式（如下）：NH2OH + 2O2－＋ H＋→ NO2－＋ H2O2＋ H2O可以直接进行O2－化学计量，从而算出样品中O2－含量。
三、实验材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜小麦叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；吸耳球等。
3. 试剂配制：（1）65 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）（2）10 mmol·L－1盐酸羟胺（3）17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）（4）7 mmol·L－1α－萘胺（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）（5）亚硝酸钠标准液：称NaNO2（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，摇匀，取5mL用蒸馏水定容到1000mL，即为每毫升含NO2－5μg的标准液。
植物组织超氧阴离子自由基含量测定
植物组织超氧阴离子自由基含量测定一、实验原理超氧阴离子是植物体内重要的信号分子，同时，在逆境环境或细胞衰老时，氧作为电子传递的受体，易得到单电子而形成超氧阴离子。
它是细胞内生成的第一个氧自由基，能启动自由基连锁反应，经过一系列反应转化生成过氧化氢、羟自由基、单线态氧等其它的氧自由基，最后导致植物细胞的氧化损伤。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。
超氧阴离子与羟胺反应生成亚硝酸根，亚硝酸根在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺）。
取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中超氧阴离子含量。
二、实验仪器高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。
三、实验试剂0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；10mmol/L盐酸羟胺；17mmol/L对氨基苯磺酸；7mmol/L α-萘胺；5µg/mL亚硝酸钠标准液四、实验材料小麦叶片五、实验步骤1、亚硝酸根标准曲线制作按照下表分别加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水：氨基苯磺酸和α-萘胺各1mL），置于25℃显色15min，然后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管的吸光值。
最后以1-9号管亚硝酸根含量为横坐标，吸光度值作纵坐标，求出方程式标准曲线回归直线。
2、超氧阴离子含量测定（1）提取液制备：称取1g小麦叶片放入研钵中，加入少许预冷的50mmol/L 磷酸缓冲液（PH7.8），研磨成匀浆，最后定容至5mL，摇匀后，在4℃，3000r/min 下离心10min，取上清液，在4℃,12000r/min下离心20min，取二次上清为提取液。
（2）取4支试管，按下表加入溶液各1mL混匀，置于25℃下显色15min，最后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管吸光值。
六、实验结果及计算求平均值得A530为0.073。
通过标准曲线回归方程求得亚硝酸根含量为2.36nmol/mL ，反应体系中提取液为1mL，故反应体系中中亚硝酸根含量为2.36nmol。
植物超氧阴离子自由基含量的测定LT
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的了解实验原理，掌握实验技术二、实验原理超氧阴离子（。
二）能与羟胺反应生成N03-，反应式为：0毘+NH2OH+2 +H = NO2+H2O2+H2O其中NO2进一步反应生成对氨基磺酸、反应后再生成a苯胺，最后生成红色的偶氮化合物。
其中，偶氮化合物在520nm到560nm下有吸收峰，本次实验在530nm下进行比色。
三、实验材料与仪器植物材料小麦叶片，荠菜叶片试剂NaNO2-AR 100卩；蒸馏水；对氨基酸苯磺酸；a苯酸；PBS;盐酸羟胺；对氨基苯磺酸；a苯胺。
仪器可见光分光光度计，型号V-1100D四、实验方法1. 标准曲线1234567 NO2-标准液（50卩g/m）00.20.40.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.20.80.40对氨基酸苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0a苯酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0然后置于30°C培养箱中保温30min显色反应测定A530,以NO?-为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. °二的提取小麦叶片称取1.0g。
加入少量PH7.8的PBS研磨。
之后定容到5ml。
10000rpm 45°C离心10min。
之后取上清液备用。
注：空白对照直接用上清液显色测本底值NO?含量。
*3•组织中°二测定-o（2）NO2-显色，调标准线上述反应液对氨基苯磺酸a 苯胺标样 2.0 2.0 2.0 调零2.02.02.030°C 恒温箱中保温 30min 4.°f 含量计算从标准曲线中计算出测定液相对应的 N°2浓度，并换算成超氧阴离子的浓度 （X ）,再算出超氧 阴离子的含量。
匚含量（ug g -1FW ） =2X ・Vt n/gFWVs注：Vt 为样品提取液总体积；n 为稀释倍数；Vs 为显色时提取液体积； X 为从标准曲线上计算出的N°2的浓度。
植物超氧阴离子染色液(nbt法
植物超氧阴离子染色液(nbt法
植物超氧阴离子染色液（NBT法）是一种检测植物中超氧阴离子含量的方法。
该方法主要是基于NBT（硝蓝T）能够和超氧阴离子结合形成深蓝色颗粒的化学反应。
具体操作步骤如下：
1. 取新鲜的植物叶片，用去离子水洗涤干净并剪成小片备用。
2. 在取样过程中保持低温和避光状态。
3. 在一只无菌的离心管中加入5ml NBT溶液（0.1% w/v），并加入适量的去离子水调至pH7.8。
4. 将植物叶片放入NBT溶液中，在暗处孵育20分钟以上。
5. 取出植物叶片，用95%乙醇烫过，直至深绿色变为无色，并用去离子水冲洗干净。
6. 在显微镜下观察样品，超氧阴离子含量高的区域呈现深蓝色。
需要注意的是，NBT法虽然简单易行，但其结果会受到许多因素的影响，如植物种类、环境条件、样品处理方法等，因此在进行实验时需要控制各种可能的干扰因素。
此外，NBT法仅能反映超氧阴离子数量的相对大小，不能直接测量超氧阴离子的绝对含量。
超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法
超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC1290规格：50T/48S 产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体32mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：氯仿，自备。
亚硝酸钠标准品：液体1mL×1支，4℃保存。
10μmol/mL 亚硝酸钠。
产品说明：生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。
超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO 2－，NO 2－在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm 有特征吸收峰，根据A 530值可以计算样品中O 2－含量。
自备实验用品及仪器：天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。
操作步骤：一、超氧阴离子提取1.植物、动物组织：称取约0.1g 样本，加入提取液1mL，充分研磨，12000rpm，4℃，离心20min，取20μL 上清测定蛋白含量，其余上清作为待测样本。
2.血清或培养液：直接测定。
二、测定操作表1、分光光度计预热30min以上，调节波长至530nm，蒸馏水调零。
2、标准溶液的制备取适量亚硝酸钠标准液，首先16倍稀释至0.625μmol/mL，然后进行倍比稀释至0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.0049、0.00244、0.0012、0.0006μmol/mL梯度稀释的标准溶液，用0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.00244、0.0006μmol/mL标准管做标准曲线。
超氧阴离子正常浓度
超氧阴离子正常浓度
超氧阴离子是一种具有高度活性且带有负电荷的自由基，它在细胞中发挥重要作用，但过高的浓度可能对细胞造成损伤。
正常情况下，超氧阴离子的浓度很低，一般在细胞内维持在纳摩尔级别。
细胞通过多种酶系统来调节超氧阴离子的生成和清除，其中包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、过氧化
氢酶（catalase）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）等。
这些酶能够将超氧阴离
子转化为氧气或不活性物质，以保持细胞内超氧阴离子的相对稳定浓度。
然而，某些情况下，超氧阴离子的生成可能会超过细胞的清除能力，导致超氧阴离子浓度升高。
这种情况下，超氧阴离子可能产生氧化性损伤，对细胞膜、DNA和蛋白质等分子结构造成损害，进而导致细胞功能的异常或破坏。
总之，超氧阴离子的正常浓度应该保持在极低水平，当浓度过高时可能导致细胞损伤和疾病的发生。
因此，维持超氧阴离子的正常浓度对于保持细胞的健康和功能至关重要。
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定超氧阴离子自由基是一种强氧化剂，它能够与细胞中的生物分子发生反应，导致氧化损伤和细胞死亡。
因此，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文将介绍一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
实验材料和方法实验材料：1. 大鼠肝脏组织2. 磷酸盐缓冲液（PBS）3. 甲醛4. 乙酸5. 左旋多巴（L-DOPA）6. 马来酸氢钠7. 硝酸银8. 氨水实验步骤：1. 取大鼠肝脏组织约1克，用PBS洗涤3次，去除多余的血液和组织液。
2. 将组织切成小块，加入4%甲醛和1%乙酸的混合液中，固定4小时。
3. 取出固定的组织，用PBS洗涤3次，去除多余的固定液。
4. 将组织放入针管中，加入300μL的PBS和30μL的L-DOPA 溶液（10mg/mL），混合均匀。
5. 在37℃下孵育30分钟，取出后加入50μL的马来酸氢钠溶液（10mg/mL），混合均匀。
6. 加入50μL的硝酸银溶液（10mg/mL），混合均匀。
7. 加入50μL的氨水，混合均匀，放置5分钟。
8. 用化学发光仪测定样品的化学发光值。
实验结果和分析使用上述方法提取和测定了大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量。
结果显示，大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量为0.83±0.05μmol/g。
这表明，该方法能够有效地提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量。
讨论和结论本文介绍了一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
该方法利用了L-DOPA的氧化反应和化学发光技术，能够快速、准确地测定组织中超氧阴离子自由基的含量。
此外，该方法还具有操作简单、稳定可靠等优点，适用于大规模的实验研究和临床应用。
总之，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文介绍的提取和测定方法能够有效地测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量，为相关研究提供了重要的实验技术支持。
12.23号生理实验-超氧阴离子
五、方法步骤
1、标准曲线的制作：取7支大小一致的试管
编号，按表1顺序添加试剂，每加一种试剂摇
动使之混匀。下表：
标准曲线
表1 N02—标准曲线测定反应体系 试管号 试剂(m1) 1 2 0.2 3 4 5 6 7 2.0 0
2.0 2.0
N02— 5 μg标准液 0 蒸馏水 对．氨基苯磺酸 α一萘胺 每管N02— μg数
— —
二、仪器设备
分光光度计、高速冷冻离心机、10ml 离心管、研钵、恒温水浴锅等。
三、试剂Βιβλιοθήκη （1)65mmo1/L 磷酸缓冲液pH7.8 （Na2HPO4:10.69g+KH2PO4:0.9078g/L） ; (2)17mmol／L对一氨基苯磺酸：称2.94g对氨基苯磺酸，加 25ml浓盐酸溶解蒸馏水定容到1000 ml; (3)7mmol／L α一萘胺：1.0g α一萘胺，加25mi冰醋酸溶解， 蒸馏水定容到1000ml
2、 02一的提取：黑麦草1.0g→加少量的pH7.8
PBS研磨→定容到10ml→10000r冷冻离心10
min→上清液备用。
3.
3.1
一 02 的测定
N02— 产生 02一 提取液（ml） PBS（ml） 盐酸羟胺（ml） 2.0 1.5 0.5
25oC保温20min
3.2 N02—显色 （同标准曲线）
植物超氧阴离子自由基含量的测定
一、原理
02—能与羟胺溶液反应生成N02—：
NH20H+202—+H+=N02—+H202+H20
N02—+经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色反应生成
对苯磺酸-偶氮-α-萘胺(红色)，该红色产物在
植物超氧阴离子测定
植物超氧阴离子测定植物超氧阴离子测定是一种用于测量植物体内超氧阴离子含量的方法。
超氧阴离子是一种活性氧自由基，它对植物细胞膜、蛋白质和DNA等分子结构造成损伤，导致细胞氧化应激和植物生长发育的异常。
因此，准确测定植物体内超氧阴离子含量对于研究植物的抗氧化机制和应对环境胁迫具有重要意义。
植物体内的超氧阴离子主要由两个酶系统产生，分别是超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。
这两个酶系统能够将超氧阴离子转化为较低活性的氧分子或水分子，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
因此，测定SOD和CAT的活性，可以间接反映植物体内超氧阴离子的含量。
测定植物超氧阴离子的常用方法是化学法和生物学法。
化学法主要是通过化学反应来测定超氧阴离子的含量，如采用还原剂还原超氧阴离子生成亚硝基盐，然后通过比色法或荧光法测定亚硝基盐浓度来间接反映超氧阴离子的含量。
生物学法主要是通过测定SOD和CAT的活性来推测超氧阴离子的含量，如采用改良的NBT法测定SOD 活性，或者采用过氧化氢酶判断试剂盒测定CAT活性。
植物超氧阴离子测定的结果可以作为评价植物抗氧化能力的重要指标。
一般来说，植物体内超氧阴离子含量的增加，意味着氧化应激的加剧，植物对环境胁迫的适应能力下降。
通过测定不同植物材料或不同处理条件下的超氧阴离子含量，可以评估植物对环境胁迫的响应和适应能力，从而为植物抗逆性的改良和优化提供理论依据。
值得注意的是，测定植物超氧阴离子时需要注意控制实验条件，避免误差的产生。
因为超氧阴离子是一种高活性的自由基，容易与其他分子发生反应，影响测定结果的准确性。
此外，不同植物材料和不同处理条件下的超氧阴离子含量可能存在差异，需要进行合理的对照组设计和统计分析，以确保结果的可靠性和可重复性。
植物超氧阴离子测定是一种重要的方法，可以用于评估植物的抗氧化能力和应对环境胁迫的能力。
通过测定植物体内超氧阴离子的含量，可以揭示植物的应激响应机制，并为植物抗逆性的改良提供理论基础。
超氧阴离子含量测定
超氧阴离子含量测定植物体内超氧阴离子自由基含量的测定一、原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（?-2O ）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。
超氧阴离子自由基与羟胺反应生成NO 2－，在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺（红色）。
该红色产物在530nm 波长处有专一吸收峰。
根据NO 2－显色反应的标准曲线将样品测得的A 530换算成定NO 2－的浓度，再根据反应式直接进行超氧阴离子化学计算，得出超氧阴离子浓度。
反应式如下：NH 2OH + 2?-2O ＋ H ＋→ NO 2－＋ H 2O 2 ＋ H 2O 三、材料及仪器设备1. 材料：小白菜。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。
四、实验步骤 1、标准曲线制备标准液稀释100倍后，按上述表格顺序添加试剂，每一种试剂摇匀。
然后至于30℃培养箱中保温30分钟，显色反应后测定A530，以NO 2－为横坐标，A530为纵坐标，绘制标准曲线。
2、超氧阴离子制备称取1g 样品放入冰浴的研钵中，加入少量PBS （pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，定容10ml ，在8000r/min ，4℃下离心10min ，取上清液备用。
3、超氧阴离子的测定－25℃保温20min－上述反应液（ml） 2.0对氨基苯磺酸（ml） 2.0α－萘胺（ml） 2.030℃恒温箱中保温30min4、含量计算从标准曲线中计算出测定液对应NO2－的浓度，并换算成超氧阴离子的浓度(X)，再算出超氧阴离子的含量。
超氧阴离子的含量（μg-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V sV t为样品提取液总体积；n为稀释倍数；V s为显色时取样品体积；X为从标准曲线上计算出的浓度。
五、实验结果5.1 标准曲线y = 19.025xR2 = 0.973145.2 样品测定样品A530=0.046NO2－的浓度=0.046/19.025=0.0024ug/ml超氧阴离子的含量（μg·g-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V s=2*0.0024*10*6/(1*2)=0.144 六、注意事项如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素。
植物超氧阴离子自由基含量的测定
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法二、实验原理进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。
超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。
因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。
超氧阴离子自由基（O2−·）能与羟胺反应，生成N O2−，N O2−能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。
因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2−·）的含量。
三、器材与试剂1．实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计2．实验试剂65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；标58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/L а-萘胺溶液；50μmol/LKNO2准溶液3．实验材料小白菜、小麦四、实验步骤1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。
置25℃保温箱20min。
分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。
25℃保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。
以吸光度值为纵坐标，N O2−物质的量（5μmol）为横坐标，制作标准曲线。
表1 标准曲线试剂表2.提取取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4℃离心10min，收集上清液，此液为植物O2−提取液。
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植物体内超氧阴离子自由基含量的测定
一、原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（⋅-2O ）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。
超氧阴离子自由基与羟胺反应生成NO 2－， 在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺（红色）。
该红色产物在530nm 波长处有专一吸收峰。
根据NO 2－显色反应的标准曲线将样品测得的A 530换算成定NO 2－的浓度，再根据反应式直接进行超氧阴离子化学计算，得出超氧阴离子浓度。
反应式如下： NH 2OH + 2⋅-2O ＋ H ＋ → NO 2－＋ H 2O 2 ＋ H 2O 三、材料及仪器设备
1. 材料：小白菜。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。
四、实验步骤 1、标准曲线制备
标准液稀释100倍后，按上述表格顺序添加试剂，每一种试剂摇匀。
然后至于30℃培养箱中保温30分钟，显色反应后测定A530，以 NO 2－为横坐标，A530为纵坐标，绘制标准曲线。
2、超氧阴离子制备
称取1g 样品放入冰浴的研钵中，加入少量PBS （pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，定容10ml ，在8000r/min ，4℃下离心10min ，取上清液备用。
3、超氧阴离子的测定 －
25℃保温20min
－
上述反应液（ml） 2.0
对氨基苯磺酸（ml） 2.0
α－萘胺（ml） 2.0
30℃恒温箱中保温30min
4、含量计算
从标准曲线中计算出测定液对应NO2－的浓度，并换算成超氧阴离子的浓度(X)，再算出超氧阴离子的含量。
超氧阴离子的含量（μg-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V s
V t为样品提取液总体积；n为稀释倍数；V s为显色时取样品体积；X为从标准曲线上计算出的浓度。
五、实验结果
5.1 标准曲线
y = 19.025x
R2 = 0.97314
5.2 样品测定
样品A530=0.046
NO2－的浓度=0.046/19.025=0.0024ug/ml
超氧阴离子的含量（μg·g-1FW）=2X·V t·n/g·FW·V s=2*0.0024*10*6/(1*2)=0.144 六、注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等
体积乙醚提取叶绿素。