第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿
第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿ppt课件
• 单克隆抗体(McAb)的应用:
• 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 • 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血 吸虫等数百种疾病的诊断。 • 在疾病治疗方面,单克隆抗体犹如人体卫士,能 识别“自己”与“异己”,一旦发现致病因素便 与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制 成“生物导弹”,将药物定向带到癌细胞所在部 位,既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 • 与常规抗体相比,具有特异性强、灵敏度高的优 点。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后,1975年,Potecrvo用该法成功
融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代
病毒诱导动物细胞融合。
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤
(1)将两种不同亲本细胞各5×l06混匀; (2)离心沉淀,吸去上清液; (3)加1ml 50%PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1
一、动物细胞融合技术
•Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无 脊椎动中发现了细胞合并现象。 •1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触 发动物细胞融合的效应。 •1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG) 化学融合法。
•1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细 胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤 细胞。 •20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞膜上,并使两细胞相互凝聚; ②在37℃中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此 时需要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2; ③细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;
动物细胞融合 PPT课件
获得产生相应 抗体的B细胞
√ BB 、B瘤 、瘤瘤
(B、瘤)
(一选)选 择性培养基: 只有杂交瘤 细胞才能存 活
单抗制备过程分哪几步?请用箭头把以下代表单克隆抗 体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺 序是?
2.3单克隆抗体的应用
单克隆抗体最主要的优点:特异性强,灵敏 度高,并能大量制备。
“太空婚礼”
2002年12月30日, 两场筹备了10年的“太 空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行,植物细胞 “新人”—黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原 生质体,动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和 骨髓瘤细胞,两批新人同时在 “产房”—电融合 仪内孕育新生命。 这两场“太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技术
B.用纤维素酶×处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞
C.用聚乙二醇作诱导剂,促使能产生抗体的B淋 巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
D.筛选杂交细胞,并从中选出能产生所需抗体的 细胞群,培养后提取单克隆抗体
动物细胞培养过程 两个过程
单克隆抗体制备过程
一个诱导细胞融合的新方法 --灭活病毒
三个“一” 一个新细胞--杂交瘤细胞
A.经过免疫的B淋巴细胞 C.经过免疫的T淋巴细胞
B.不经过免疫的T淋巴细胞 D.不经过免疫的B淋巴细胞
【例5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的
( D)
A. B淋巴细胞
B.T淋巴细胞
C.骨髓瘤细胞
D.杂交瘤细胞
【例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体,下
列实验步骤中错误的是( B )
A.将抗原注入小鼠体内,获得能产生抗体的B淋 巴细胞
植物体细胞杂交技术 动物细胞融合技术
植物体细胞杂交过程示意图
《动物细胞融合技术》 讲义
《动物细胞融合技术》讲义一、动物细胞融合技术的概念动物细胞融合技术,简单来说,就是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
这一技术在生物学和医学领域具有重要的意义和广泛的应用。
二、动物细胞融合技术的原理细胞融合的基本原理是细胞膜具有一定的流动性。
当两个或多个细胞靠近时,细胞膜会发生变形和融合,从而使细胞质和细胞核相互融合,形成一个新的杂种细胞。
在细胞融合过程中,通常需要使用一些诱导剂来促进融合的发生。
常见的诱导剂包括病毒(如仙台病毒)、化学物质(如聚乙二醇,PEG)和电刺激等。
这些诱导剂能够改变细胞膜的性质,增加细胞膜的通透性和流动性,从而促使细胞融合。
三、动物细胞融合技术的方法1、病毒诱导法仙台病毒是最早用于诱导动物细胞融合的病毒之一。
病毒的包膜上含有能够促进细胞融合的融合蛋白。
当病毒与细胞接触时,融合蛋白能够介导细胞膜的融合。
然而,由于病毒具有致病性和潜在的生物安全风险,目前这种方法的使用相对较少。
2、化学诱导法聚乙二醇(PEG)是目前应用最为广泛的化学诱导剂之一。
PEG 能够使细胞膜的磷脂双分子层结构发生紊乱,导致细胞膜的通透性增加,从而促进细胞融合。
具体操作时,将待融合的细胞混合在含有 PEG 的溶液中,经过一段时间的处理后,细胞就能够发生融合。
3、电融合法电融合法是通过在两个细胞之间施加短暂的高强度电场,使细胞膜发生穿孔和融合。
这种方法具有融合效率高、对细胞损伤小等优点,但设备要求较高。
四、动物细胞融合技术的应用1、单克隆抗体的制备单克隆抗体是由单个 B 淋巴细胞克隆形成的细胞群所产生的抗体。
通过动物细胞融合技术,将能够产生特定抗体的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞既能无限增殖,又能产生特异性抗体,从而实现了大规模生产单克隆抗体。
单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防等方面发挥着重要作用,如肿瘤的靶向治疗、自身免疫性疾病的治疗等。
2、细胞工程药物的生产利用动物细胞融合技术,可以将具有特定功能的细胞融合在一起,构建能够高效生产药物的工程细胞。
细胞生物学实验报告——动物细胞融合
山东大学细胞生物学实验报告聚乙二醇(PEG )法诱导的动物细胞融合实验2012/9/11实验目的:了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理,用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验,掌握实验的基本操作,观察鸡血红细胞融合的不同时期。
实验原理:1. 细胞融合的概念两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合,细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。
细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。
2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导,化学诱导和物理诱导。
1953年,M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台病毒(HVJ )[1]。
1958年,日本学者Okada 发现仙台病毒(HVJ )能诱导动物细胞融合[2],其基本原理是仙台病毒的衣壳上有细胞表面受体的结合位点,可以诱导不同细胞凝集,最终使不同细胞的细胞膜相互融合。
1974年,加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇(Polyethyleneglycol ,PEG )化学融合法,由于该方法对实验条件要求极低,试剂易得,操作简单,成为应用最广泛的细胞融合方法。
化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重排,相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。
比之于仙台病毒诱导法,PEG 诱导法的效率提高了几百倍。
80年代,科学家发明了细胞电融合法[4, 5],电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。
电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。
当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时,细胞表面会发生极化现象,相邻的细胞将吸附在一起。
这时突然提高电场强度,细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿,细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。
图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 (引自J. Teissie 等,1982 )。
动物细胞融合过程示意图
骨髓瘤细胞
B
杂交瘤细胞
C
足够数量的细胞群 体外培养 注射到 小鼠腹腔
原代 (5).C过程指细胞培养,该过程包括________培养和 传代 50 __________培养两个阶段,其中_____代以内的的细胞属于 细胞株。
1. 单克隆抗体制备过程中,骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后,要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞, 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 ( C ) ①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞 A.②④ B.①③⑤ C.①②③④ D.②③
酶解法,如纤维素酶和果胶酶
2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗?为什么?
无需,因为动物细胞无细胞壁
3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些?
离心、电激等物理方法;PEG等化学方法
4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗?还有其他方法吗?
能 还可以利用灭活的病毒进行诱导
5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体,动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗?
不能
二、单克隆抗体
1.抗体是由何种细胞产生的?
效应B细胞(浆细胞)
提 问
2.一个B淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗?
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
3. 引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗? 4. 简述获得抗体的传统途径?
动物在免疫反应过程中,体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上
?
抗原
B
)
C.电刺激
4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法,设计的生产破 伤风杆菌的实验方案
A
制备单克隆抗体 (1).该实验方案的目的是:________________ (2).该方案能达到预期效果吗?为什么? 不能,没有将抗原注入小鼠体内,无法获得产 生单一抗体的B淋巴细胞。 (3).A是从小鼠的脾脏中取得__________ 该细胞能 B淋巴细胞 抗体 够产生______ 。 细胞融合 (4).图中B为________________过程,常用 灭活的病毒 _________________作为诱导剂,该细胞继承 ___________的遗传特性,既能__________,又能 双亲细胞 分泌抗体 无限增殖 ___________。
细胞融合与杂交瘤技术ppt课件
成功年代
1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972
1972
植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的 细胞,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞。
细胞融合与杂交瘤技术
动物细胞融合实验使用的小白鼠
技术
原生质体融合
细胞拆合——人为方法,人为组合
细胞融合Байду номын сангаас杂交瘤技术
1. 生物法——仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:
① 两种细胞在一起培养,加入病毒,在4℃条件下病毒附 着在细胞膜上,并使两细胞相互凝聚;
② 在37℃中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环, 此时需要Ca2+和Mg2+,最适pH为8.0一8.2;
勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合 过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG 可能对细胞有毒害。
细胞融合与杂交瘤技术
聚乙二醇(PEG)法细胞融合过程 细胞融合与杂交瘤技术
细胞融合与杂交瘤技术
聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤
① 将两种不同亲本细胞各5×l06混匀; ② 离心沉淀,吸去上清液; ③ 加1ml 50%PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1
第六章 细胞融合与杂交瘤技术
细胞融合与杂交瘤技术
第一节 细胞融合技术 第二节 杂交瘤技术与
单克隆抗体的生产
细胞融合与杂交瘤技术
第一节 细胞融合技术
一、细胞融合概述 二、细胞融合的基本原理 三、细胞融合的常用方法 四、融合细胞的筛选
细胞融合与杂交瘤技术
一、细胞融合概述
1. 定义
动物细胞融合
式细胞仪等技术。单克隆抗体促进了商品化试剂盒的开 展,试剂盒灵敏度高、使用方便、快速,用于病原微生 物抗原、肿瘤抗原、免疫细胞及其亚群的检测,激素、 细胞因子的测定。
2. 食品安全的检测
食品中的毒素〔如黄曲霉毒素〕、有机农药的检测。 方便、灵敏
3.蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆
断;HGPRT缺乏,DNA合成的补救途径受阻,不
能生长,5~7天死亡;
淋巴细胞和骨髓瘤融合细胞:能生长
〔4〕 杂交瘤细胞的选择和克隆化培 养
第一次抗体筛选:融合培养24h后更换成HAT 选择性培养液,杂交瘤细胞生长增殖、形成 细胞群,再利用免疫学方法检测其抗体合成。 第二次抗体特异性筛选:从杂交瘤细胞群中 筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特 异性杂交瘤细胞。
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分 泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中只产生一种 抗体。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞,因此, 当机体受抗原刺激时,每种B淋巴细胞产生一种抗体 〔单一抗体疫动物生产、制备抗体效率 低,且多克隆抗体应用有很多缺陷,别离这些不同 的抗体极为困难。
1〕 取1.0 ml 5×104/ml细胞+4ml培养基稀释,得 1×104/ml. 2〕 取0.5ml 1×104/ml细胞液+4.5ml培养基稀释, 得1×103/ml. 3〕 取0.5ml1×103/ml细胞液+4.5ml培养基稀释, 得100 cells/ml. 4〕 取0.01ml的 100 cells/ml细胞液于培养板小孔, 加0.1 ml培养基,培养后得杂种细胞系。
杂交瘤技术实验原理及其操作演示
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法:
动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法
动物免疫 BALB/c
X抗原
B淋巴细胞 瘤的突变株
培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
分泌X抗体 B淋巴细胞
培养数天后细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ死亡
骨髓瘤细胞 无限生长细胞
细胞融合 混合细胞的HAT筛选)
单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
1 week later
正常培养基
三、抗体的检测
常用方法:
要求:
➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法
一、杂交瘤技术产生的3个技术关键
1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性:
B淋巴细胞(B lymphocytes): 接受抗原刺激后,能分泌针对该抗原的特异性
抗体,在体液免疫中具有重要功能。 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞,通常不再
进行细胞分裂,存活一段时间后便会死亡——短命 细胞
骨髓瘤细胞 (myeloma cells):
免疫途径: 皮下注射 腹腔注射 静脉注射
常规免疫法:
第1次免疫:抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射) 第2次免疫:抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射)
第3次免疫:抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) 第4次免疫:抗原+不加佐剂 (静脉注射)
二、细胞融合及HAT筛选
杂交瘤技术
整理课件
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10.1.1 融合用骨髓瘤细胞
用于融合的骨髓瘤细胞大多能耐受抑制细胞代谢的毒性药物 8- 氮 鸟 嘌 呤 , 是 一 种 缺 乏 次 黄 嘌 呤 鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT) 的遗传缺陷型肿瘤细胞,在HAT选择培养液中不能生长。
饲养细胞要达到一定的浓度才具有促进细胞生长的 作用。每孔的数量不应少于104个。
整理课件
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10.3.6 免疫脾细胞的制备
处死小鼠,消毒后固定于解剖架上打开腹腔, 在左后腹部取出脾脏。
按上述研磨胸腺的办法,获取单个脾脏细胞。 计数有核细胞(用苔盼蓝液作活细胞计数),
一个脾脏可获约108个细胞,1000rpm×5min离 心,沉淀细胞重悬于适量的培养液中备用。
融合用的小鼠骨髓瘤细胞株有NS-1、SP2/0和X63等。 HAT代表次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基碟呤
(aminopterin,A)和胸腺嘧啶(thymidine, T)三种物质。
整理课件
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10.1.2 HAT选择性培养
肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径,一是生物合成的主要 途径,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,进而合 成DNA。在核酸合成过程中,叶酸衍生物为合成核苷酸所必 需,氨基碟呤是一种叶酸拮抗物,它可阻断细胞内DNA生物 合成的主要途径。
动物免疫
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合
HAT选择培养
阳性杂交瘤筛选
克隆化培养
整理课件
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10.3.1 免疫抗原
抗原物质主要分为可溶性抗原和颗粒性抗原。 可溶性抗原包括蛋白质、碳水化合物和核酸等。常与福
动物细胞工程—动物细胞融合
动物细胞融合与植物细胞杂交的比较
动物细胞融合与植物细胞杂交的比较
动物细胞融合
植物细胞杂交
融合原理 融合预处理 诱导方法
细胞膜流动性
细胞膜流动性,植物细胞全能型
用胰岛蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散 用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导
后诱导细胞融合
原生质体融合
灭活的病毒、电激、聚乙二醇
电激、振动、离心、聚乙二醇
结果 应用
杂交细胞
杂交植株
制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等
克服远缘杂交不亲和的障碍,扩展杂交 亲本范围,培育新品种
思考题:
思考题:
为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活?不灭活的病毒可以作为诱 导剂吗?
自发融合:同种细胞在培养时2个靠在一起 的细胞自发合并。 诱发融合:异种间的细胞必须经诱导剂处理 才能融合。
第二章
动物细胞融合原理
动物细胞融合原理
动物细胞融合原理 原理:细胞膜具有一定的流动性
诱导融合因素: 生物方法(病毒) 化学方法(聚乙二醇PEG) 物理方法(离心,震动,电刺激)
基因产物:mRNA、tRNA、rRNA
第三章
动物细胞融合的具体步骤
动物细胞融合的具体步骤
动物细胞融合的具体步骤
细胞准备
细胞融合
杂种细胞 选择
杂种细胞 克隆
分贴壁和悬浮细胞两 种。前者可直接将两 亲本细胞混合培养, 后者需制成一定浓度 的细胞悬浮液。
加促融因子于将 行融合的细胞之 中,诱导融合。
利用选择性培养 基等,使亲本细 胞死亡,而让杂 种细胞存活。
动物生物技术
动物细胞融合
第一章
动物细胞融合
动物细胞融合
动物细胞融合
第十一章生物技术与工程课时4动物细胞工程-2025年高考生物备考教案
课时4动物细胞工程课标要求核心考点五年考情核心素养对接1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织,分散成单个细胞后,在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。
动物细胞培养是动物细胞工程的基础;2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中,并使重组细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的过程;3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段,使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程;4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术;5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值动物细胞培养和干细胞的应用2023:辽宁T7、海南T7、湖南T21(4);2022:海南T20(1)(3)(4)、湖北T7、江苏T14;2021:湖南T22(2)、重庆T5、浙江1月T18;2020:江苏T231.生命观念——深入理解动物细胞核移植和克隆技术,理解生命的发生、发展过程。
2.科学思维——分析动物细胞培养的条件、细胞融合和单克隆抗体制备的原理,形成科学思维的习惯。
3.科学探究——通过动物细胞培养操作,培养科学探究能力。
4.社会责任——了解生物工程技术在生产上的应用,认同生物技术对社会发展的影响,承担应有的社会责任动物细胞融合技术和单克隆抗体2023:北京T12、湖北T22(1)(2)(3);2022:浙江1月T29(二)(3)、辽宁T24Ⅱ、江苏T19、山东T15;2021:山东T15;2020:江苏T28(4)、全国ⅠT38;2019:江苏T23动物体细胞核移植技术和克隆动物2023:天津T7;2021:辽宁T13、湖南T22(3);2020:天津T1命题分析预测1.高考对本部分的考查常以生产或科研实践为情境,也可以图为载体,主要考查动物细胞培养、动植物细胞融合的异同、单克隆抗体的制备等,既有选择题,也有非选择题。
2.预计2025年高考仍可能延续往年的考查形式及特点,与基因工程、胚胎工程等其他知识相结合进行命题考点1动物细胞培养和干细胞的应用学生用书P3331.动物细胞培养(1)动物细胞培养的原理、条件和过程辨析细胞贴壁和接触抑制(1)细胞贴壁是指体外培养的细胞贴附在培养瓶的瓶壁上生长的现象;接触抑制是指当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞通常会停止分裂增殖的现象。
动物细胞工程ppt
(一)获得抗体的传统方法
2、缺点:
产量低,纯度低,特异性差。
把某种抗原反复注射到动物体内,然后从动物血清中分离出所需的抗体。
人们发现,在动物发生免疫反应的过程中,体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体,但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体,必须克隆单一的B淋巴细胞,形成细胞群。
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体
单击添加副标题
专题2 细胞工程
植物体细胞杂交的意义:
打破生殖隔离,克服远缘杂交不亲和的障碍,培育作物新品种。
一、动物细胞融合
细胞融合是正常的生命活动。 两个细胞正在融合 受精作用
(一)动物细胞融合的概念
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添加标题
细胞A
添加标题
物理法 化学法
我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道,体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上,但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,如果仅取一个脾细胞(含B淋巴细胞)和一个瘤细胞杂交,我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的;若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合,就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
添加标题
细胞B
添加标题
杂种细胞 灭活的病毒
ห้องสมุดไป่ตู้
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
细胞核
病毒颗粒
细胞核
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合,形成杂种细胞 (细胞膜具有一定的流动性)
两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的
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(三)动物细胞融合的应用
杂交瘤技术的基本原理及技术流程
杂交瘤技术的基本原理及技术流程下载提示:该文档是本店铺精心编制而成的,希望大家下载后,能够帮助大家解决实际问题。
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动物细胞融合PPT课件
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浆细胞可以产生抗体,但是 不能连续分裂。
思考:如何利用动物细胞融合 解决浆细胞不能连续分裂的问 题?
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不同DNA的两个细胞 灭活病毒诱 导细胞融合
融合后的细胞 进行有丝分裂
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总结:比较植物体细胞杂交和动物细胞融合
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性、 植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
融合前处理
用纤维素酶 果胶酶去壁
用胰蛋白酶 使细胞分散
诱 导方法
物理、化学方法
物理、化学、 生物方法
动物细胞融合1ຫໍສະໝຸດ 动物细胞与植物细胞的差别:
• 无细胞壁 • 全能性受限制,不能发育成杂种动物
•动物细胞融合与植物细胞杂交的不同:
•不需去除细胞壁 •不能发育成新的动物个体
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定义
植物体细胞杂交:将不同种的植物体 细胞,在一定条件下融合成杂种细胞, 并把杂种细胞培育成新的外植体的技 术。 指两个或多个动物细胞结合形成一个 细胞的过程。
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原理
细胞膜的流动性
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诱导方式
• 物理法:离心、振动、电激 • 化学法:聚乙二醇(PEG) • 生物法:灭活的病毒 • 思考讨论:为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活?
不灭活行吗? • 不灭活的话会感染胞,而不能诱导细胞融合
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动物细胞融合过程
不同DNA的 两个细胞
诱导细胞融合
融合后的细胞 进行有丝分裂
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G. Kohler
杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限 增殖,又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 增殖,又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 因此单克隆抗体技术又称为杂交瘤技 因此单克隆抗体技术又称为杂交瘤技(hybridoma
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段: 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:
①两种细胞在一起培养,加入病毒,在4℃条件下病毒附着在 两种细胞在一起培养,加入病毒, ℃ 细胞膜上,并使两细胞相互凝聚; 细胞膜上,并使两细胞相互凝聚; 病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环, ②在37℃中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此 ℃ 时需要Ca 最适PH为 时需要 2+和Mg2+,最适 为8.0一8.2; 一 ; ③细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP; 细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需 ; ④融合成巨大细胞,仍需ATP 。 融合成巨大细胞,仍需
一、动物细胞融合技术
1、病毒诱导融合法(生物法) 病毒诱导融合法(生物法)
•是副粘病毒科的一些病毒,如仙台病毒、副流感病毒和新 是副粘病毒科的一些病毒,如仙台病毒、 的一些病毒 城鸡瘟病毒,其中仙台病毒最常用。 城鸡瘟病毒,其中仙台病毒最常用。 •1962年,日本的冈田善雄(Okada) 发现日本血凝性病毒 1962年 日本的冈田善雄(Okada) 1962 (HVJ)也叫仙台病毒, (HVJ)也叫仙台病毒,引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细 也叫仙台病毒 胞的现象. 胞的现象. •1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融 1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融 1965年英国的Harris 合方面做了大量的工作,并进一步利用这种灭活病毒来诱导 合方面做了大量的工作, 不同种动物细胞间的融合。 不同种动物细胞间的融合。
•仙台病毒诱导融合机理是: 仙台病毒诱导融合机理是: 仙台病毒诱导融合机理是 病毒囊膜上的刺突( 病毒囊膜上的刺突(具凝血活性何唾液酸 苷酶活性)与细胞膜上糖蛋白起作用, 苷酶活性 ) 与细胞膜上糖蛋白起作用 , 使 细胞发生凝聚, 细胞发生凝聚 , 使膜上的蛋白质使脂类分 子重排,打开质膜,导致细胞融合。 子重排,打开质膜,导致细胞融合。
病毒诱导融合法的特点:
优点:对各种动物细胞都适宜;病毒繁殖量大, 优点:对各种动物细胞都适宜;病毒繁殖量大, 易培养。 易培养。 缺点:制备困难、操作复杂、 缺点:制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差 异大、实验的重复性差、融合率很低, 异大、实验的重复性差、融合率很低,另外病毒 可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 目前,这种方法主要适用于动物细胞融合, 目前,这种方法主要适用于动物细胞融合,用于 实验室研究。 实验室研究。
二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产
(一)何谓单克隆抗体?(monoclonal antibody,McAb) 何谓单克隆抗体? ) • 抗体(Antibody,Ab):是指能和相应抗原特异性结合的 抗体( ):是指能和相应抗原特异性结合的 ): 具有免疫功能的球蛋白。 具有免疫功能的球蛋白。 • 抗原 抗原(Antigen,Ag):能启动机体的免疫应答,且能与其免 , :能启动机体的免疫应答, 疫应答产物(抗体或免疫效应细胞 特异性结合, 抗体或免疫效应细胞)特异性结合 疫应答产物 抗体或免疫效应细胞 特异性结合,并发生一 系列生物学效应的物质。 系列生物学效应的物质。 • 免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig):是指具有抗体活性的 免疫球蛋白( ) 是指具有抗体活性的 或化学结构与抗体相似的球蛋白。 或化学结构与抗体相似的球蛋白。 • 抗体和免疫球蛋白的关系:抗体是免疫球蛋白,并非所有 抗体和免疫球蛋白的关系:抗体是免疫球蛋白, 的免疫球蛋白都具有抗体活性。 抗体结构图) 的免疫球蛋白都具有抗体活性。 (抗体结构图) 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体
technology )。
C. Milstein
1、免疫小鼠 、
对抗原的要求是纯度越高越好 纯度越高越好, ◇ 对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用 的抗原。主要有细菌性抗原和病毒性抗原。 的抗原。主要有细菌性抗原和病毒性抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALb/c健康小鼠,鼠龄 健康小鼠, ◇ 选择与所用骨髓瘤细胞同源的 健康小鼠 在8~12周,雌雄不限。 ~ 周 雌雄不限。 ◇ 免疫过程和方法因动物、抗原形式、免疫途径不同而异, 免疫过程和方法因动物、抗原形式、免疫途径不同而异, 以获得高效价抗体为最终目的。 以获得高效价抗体为最终目的。 免疫间隔一般2~ 周 ◇ 免疫间隔一般 ~3周。 抗原量同样与抗原强弱有关, 为例, ◇ 抗原量同样与抗原强弱有关,以IgG为例,第一次为 为例 looµg,第二次为 µg,免疫途径第一次可经腹腔注射。 µ ,第二次为50µ ,免疫途径第一次可经腹腔注射。 每次腹腔注射1× 每次腹腔注射 ×l06一1×107。 ×
免 疫 球 蛋 白 的 基 本 结 构
抗原分子表面( 抗原分子表面(有的在内 部),决定该抗原特异性 ),决定该抗原特异性 的特殊化学基团。 的特殊化学基团。 • 抗原以抗原决定簇与相应 淋巴细胞的抗原受体结合 而激活淋巴细胞引起免疫 应答; 应答; • 抗原与相应抗体的特异性 结合也通过抗原决定簇来 完成 。 • 每一个抗原决定簇,其性 每一个抗原决定簇, 质和空间构型决定着一种 特异性, 特异性,可与一种抗体结 合。一个抗原分子可以有 一种或多种不同的抗原决 定簇
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇( 聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤 )
(1)将两种不同亲本细胞各 ×l06混匀; )将两种不同亲本细胞各5× 混匀; (2)离心沉淀,吸去上清液; )离心沉淀,吸去上清液; 溶液, (3)加1ml 50%PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触 ) % 溶液 用吸管吹打,使之与细胞接触1 分钟; 分钟; 培养液,离心沉淀,吸去上清液; (4)加9ml 培养液,离心沉淀,吸去上清液; ) 培养液,分别接种5个直径 个直径60mm平皿,每个平皿 平皿, (5)加5ml 培养液,分别接种 个直径 ) 平皿 培养箱中培养。 加培养液至 5ml,37℃的CO2培养箱中培养。 , ℃ 小时后, (6)6—24小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。 ) 小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) PEG成功诱导植物原生 继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后,1975年 Potecrvo用该法成功融 质体融合后,1975年,Potecrvo用该法成功融 合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代病 合动物细胞。 毒诱导动物细胞融合。 毒诱导动物细胞融合。
2、脾细胞的制备 、
(1)引颈处死小鼠,用酒精消毒体表; (1)引颈处死小鼠,用酒精消毒体表; 引颈处死小鼠 (2)无菌条件下取出脾脏,剃除结缔组织和脂肪, 5ml无血清培养液冲洗一次; (2)无菌条件下取出脾脏,剃除结缔组织和脂肪,用5ml无血清培养液冲洗一次; 无菌条件下取出脾脏 无血清培养液冲洗一次 (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中; (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中; 把脾脏置于已消毒的90 目不锈钢网或尼龙纱网中 (4)在脾中部切开一小口,用注射器芯从一端轻轻压挤,再用无血清培养液冲洗, (4)在脾中部切开一小口,用注射器芯从一端轻轻压挤,再用无血清培养液冲洗, 在脾中部切开一小口 令细胞通过纱网,收集入平皿中,或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 令细胞通过纱网,收集入平皿中,或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 3ml 液,反复抽吸数次方法获取细胞,再制成细胞悬液亦可; 反复抽吸数次方法获取细胞,再制成细胞悬液亦可; (5)把细胞悬液注入50ml离心管中, l0一20ml培养液:轻轻吹打数次, (5)把细胞悬液注入50ml离心管中,加l0一20ml培养液:轻轻吹打数次,室温中 把细胞悬液注入50ml离心管中 培养液 置5分钟; 分钟; (6)离心(800一1000转 (6)离心(800一1000转/分)计数、备用。 离心(800 计数、备用。
第十一章 动物细胞融合与杂交瘤技术
一、动物细胞融合技术 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产
一、动物细胞融合技术
•Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地 于 年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地 年观察到 融合产生多核的肿瘤细胞 产生多核的肿瘤细胞。 融合产生多核的肿瘤细胞。 •Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤 于 年描述了正常组织、 年描述了正常组织 组织中的多核细胞现象。 组织中的多核细胞现象。 •Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的 于 年观察到天花病人的血液中也有多核的 血细胞存在。 血细胞存在。 •Lange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液 于 年第一个观察到脊椎动物( 年第一个观察到脊椎动物 蛙类) 细胞发生融合的过程。 细胞发生融合的过程。
《生物工程总论》 生物工程总论》
之 “细 胞 工 程” 篇
专业: 专业:生物工程 授课人: 授课人:苗永美
讲授内容及学时分配表
第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章 第十二章 第十三章 绪论 实验室的组成及无菌操作技术 植物细胞工程的基本原理 植物离体无性快繁和脱毒技术 植物细胞培养及次生物质的生产 原生质体培养和体细胞杂交 植物花粉、 植物花粉、花药及单倍体育种 植物胚胎培养 种质资源的离体保存 动物细胞培养技术 动物细胞融合和杂交瘤技术 动物胚胎工程 动物干细胞技术 2学时 2学时 3学时 2学时 3学时 3学时 2学时 1学时 1学时 3学时 2学时 3学时 2学时