时间分辨荧光免疫分析的原理
时间分辨技术的原理
时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。
根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。
2、时间分辨原子标记物的特点：●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性原子标记与大分子标记物的对比3、波长分辨：●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。
●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。
4、时间分辨：●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。
●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有利于提高检测的准确性。
时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！RIA（放免）●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。
●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。
●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线无法保存备用。
ELESA（酶免）●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。
●酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。
与其它技术的相对优势：（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的TRF技术与电化学发光的比较TRF与化学发光的比较时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
时间分辨荧光免疫 镧系元素
时间分辨荧光免疫镧系元素
时间分辨荧光免疫分析是一种用于检测和测量样品中存在的特定物质的方法。
在这种分析中，使用镧系元素作为荧光标记物，其具有独特的荧光特性，能够在特定激发光的作用下发出特定的荧光信号。
以下是关于时间分辨荧光免疫和镧系元素的一些方面：
1. 方法原理，时间分辨荧光免疫分析是基于样品中目标物质与特定抗体结合形成复合物，然后加入标记有镧系元素的二抗，通过激发光激发镧系元素，测量其发出的荧光信号来定量分析目标物质的含量。
2. 镧系元素的选择，镧系元素由于其稀土特性，具有多种发射波长和长寿命的荧光特性，能够减少背景干扰，提高检测灵敏度和准确性，因此被广泛应用于时间分辨荧光免疫分析中。
3. 应用领域，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物已被广泛应用于生物医学、环境监测、药物研发等领域，用于检测蛋白质、激素、细胞因子等生物分子的含量和活性。
4. 技术优势，与传统的荧光免疫分析方法相比，时间分辨荧光
免疫分析结合镧系元素标记物具有更高的检测灵敏度、更低的背景干扰和更广泛的应用范围，因此受到了广泛关注和应用。
总的来说，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物是一种高效、灵敏度高的分析方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用前景。
希望以上信息能够帮助你更全面地了解这一技术。
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
时间分辨荧光技术原理及应用
免疫细胞
免疫器官
按其功能不同分为： 中枢免疫器官：
免疫细胞发生、分化和 成熟的场所。
包括：胸腺和骨髓(人和 哺乳动物)；法式囊(禽类)。
外周免疫器官及组织 ： 1.B细胞成熟的场所； 2.免疫应答的发生部位。 包括：淋巴结 脾脏 粘膜
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA） 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电 场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，锝(Te) 可实现多项目同时检测，
减少操作偶然误差。
原子标记技术
多个标记位点（多达20个）灵敏度更高。 原子标记，对抗体结构影响小，保证检测的高灵敏
性，高精确度。 惰性元素，无衰变保质期1年。 物理发光影响小，受环境影响小，可以多次检测。 解离增强技术可使其荧光性提高100万倍，线性范围
钩状效应在凝集曲线上表现为类似抛物线的形状。
医学免疫学化诊断技术
医学免疫学化诊断技术分为： 同位素放射免疫 非放射免疫分析
吸收光谱法
酶联ELSIA
发射光谱法
酶联化学发光 直接化学发光 电化学发光 荧光偏振 时间分辨
主流化学发光介绍
发光免疫分析：是将发光分析和免疫反应相结合而建立 起来的一种新的检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术。
1876年 多种病原菌被发现——疫苗广泛应用
抗原抗体的基本概念
抗原（antigen,Ag)
是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效 应的物质。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨免疫荧光微球
时间分辨免疫荧光微球1. 引言1.1 背景介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物标记技术，可以对免疫学实验数据进行高效、准确的检测分析。
随着生物技术的发展和应用，对于细胞分析和药物筛选等领域的需求日益增加，传统的免疫荧光检测方法已经不能满足科研和临床的需求。
研究人员开始探索新的技术手段来提高实验的灵敏度和准确度。
时间分辨免疫荧光微球具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，可以同时检测多种生物标记物，实现快速、准确地定量分析。
其原理基于微球上包裹有特定的免疫荧光标记物，当这些微球与待测样品中的靶分子结合时，通过流式细胞仪等仪器可以实时监测免疫反应的强度和时间，从而获得更精确的实验数据。
通过时间分辨免疫荧光微球技术，研究人员可以更加深入地了解细胞内的免疫反应过程，快速筛选药物的活性和副作用，为疾病诊断和治疗提供重要的参考依据。
随着该技术在生命科学领域的不断应用和发展，相信将会有更多的创新和突破出现，为人类健康和生命的发展带来积极的影响。
1.2 研究目的研究目的是通过研究时间分辨免疫荧光微球，深入探究其在生物医学领域中的应用潜力。
通过了解其原理和实验方法，我们的目的是揭示其在疾病诊断、药物递送和细胞标记等方面的优势和局限性，为其未来的应用前景做出预测。
通过这项研究，我们希望能够为生物医学领域的研究和临床实践提供新的技术手段和思路，为推动医疗健康行业的发展做出贡献。
2. 正文2.1 原理介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物分析技术，利用微球作为载体，结合免疫荧光标记技术，实现对不同生物标记物的高灵敏、高特异性检测。
其原理基于时间分辨光谱技术，通过采集微球悬液中的荧光信号，在不同时间点进行检测和分析，从而实现对样品中不同荧光标记物的准确识别和定量测定。
在时间分辨光谱技术中，光谱仪器以一定的时间间隔对样品中的荧光信号进行连续检测，通过对这些时间点上的信号强度和波长进行分析，可以区分出不同的荧光标记物并消除背景信号的干扰。
时间分辨荧光免疫技术
定量
ELISA（定性）
意义
0~10mIU/ml 10~100mIU/ml
>100mIU/ml
阴性（-） 阳性（+）` 阳性（+）
机体对乙肝病毒无免疫力，易感染 乙肝病毒
机体对乙肝病毒的免疫力很弱，甚 至不能预防HBV感染，仍有感染 HBV的危险
机体对乙肝病毒有较强的免疫力， 使机体有抵抗HBV入侵的作用，较 大程度上减少感染HBV的风险
而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6 个数量级（1000ns=1us)。 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。 因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变 后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样 品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除 样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的 时间分辨。
放射性（125I），对环境的污染及对 身体的危害，已经为重视环保的国家
命性的贡献，是一项 逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个
较为成熟的诊断技术。 放免试验室）
125I的半衰期短而导致其试剂有效期
夹心法、竞争法的标 记原理为以后的检测
短。 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒
技术的发展奠定了基 础。
WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床
标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素
镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中 有四种：
铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)
Eu3 +的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术
时间分辨荧光免疫测定原理
时间分辨荧光免疫测定原理时间分辨荧光免疫测定（TRFIA，Time Resolved Fluorescence Immunoassay）是一种非同位素免疫分析技术。
它利用镧系元素（如铕、铽等）标记抗原或抗体，通过测量荧光强度和时间两个参数来检测待测物。
与传统的荧光免疫分析相比，TRFIA具有更高的灵敏度和特异性，能有效排除非特异性荧光的干扰。
TRFIA的分析原理主要包括以下几个方面：1.镧系元素标记：将镧系元素与抗原或抗体结合，形成具有荧光性质的标记物。
镧系元素的荧光具有较长的寿命，且发光强度与抗原或抗体的结合程度密切相关。
2.时间分辨技术：通过时间分辨技术对荧光信号进行测量，即在一定时间内对荧光信号进行积分和分析。
这种技术能够有效地区分特异性荧光信号和背景荧光信号，提高分析灵敏度。
3.信号分辨：通过检测波长和时间两个参数来分辨特异性荧光信号和非特异性荧光信号。
由于生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度会严重下降。
而TRFIA方法通过时间分辨技术使瞬时荧光干扰减到最小化。
4.激发光控制：TRFIA方法在测量时采用延迟测量时间的方法，有效地消除背景荧光的干扰。
同时，解决激发光的杂散光影响也是提高灵敏度的关键。
5.数据分析：通过对测量得到的荧光信号进行数据分析，得到待测物的浓度。
TRFIA方法能够实现对超微量样品的高灵敏度检测，具有很高的分析精度。
总之，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种基于镧系元素标记、时间分辨技术、信号分辨、激发光控制和数据分析等原理的一种高灵敏度、高特异性的免疫分析方法。
在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。
血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。
目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。
产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。
目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β-）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3抑制素A（inhibin A）等。
产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。
产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。
检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。
由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。
假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。
二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。
1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。
1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。
唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。
简述时间分辨荧光免疫测定的基本原理
简述时间分辨荧光免疫测定的基本原理时间分辨荧光免疫测定，听起来高大上吧？其实它的原理就像一场精彩的侦探游戏，特别有趣。
这种方法主要是利用荧光的特性，通过时间上的分辨来探测特定的物质，比如某种抗原。
想象一下，我们在黑暗的房间里用手电筒找东西，手电的光亮与阴影的交替就像我们在寻找目标一样。
这里的“时间分辨”就是告诉我们光亮和阴影出现的时刻，帮助我们找出那隐藏在黑暗中的小秘密。
我们得了解荧光是怎么一回事。
它就是一种物质吸收光之后，再发出不同颜色光的现象，像一颗星星在夜空中闪烁。
当我们把标记有荧光物质的抗体加入到样本中时，抗体就像小侦探一样，奔向目标抗原，紧紧抓住不放。
这个过程简直像是小猫追小鼠，一旦抓住，荧光物质就会发光，变得特别显眼。
你想想，咱们一闪一闪的光亮就是小侦探给我们发出的信号。
而时间分辨的魅力就在于，它不仅仅看光亮有多强，还要看光亮是多早、多晚出现的。
这就像你在等朋友，不同的人到达的时间不一样，第一位到达的总是最早，最后到的可能有点迟。
这种时间上的差异能帮助我们更加精准地分析样本中到底含有什么物质。
这种方法的敏感度特别高，甚至可以检测到极少量的目标分子，简直就是细微之处见真章。
如果说荧光是主角，那么时间分辨就是它的绝佳搭档。
通过特殊的仪器，我们可以精确测量荧光信号出现的时间，这样就能排除背景噪声的干扰，得到更干净、清晰的结果。
想象一下，一场音乐会，主唱声音洪亮，但如果伴奏乐器的杂音太多，听起来就会让人受不了。
时间分辨就是在帮助我们过滤那些“杂音”，让主唱的声音更加动听。
说到这里，可能有人会问，这种方法有什么实际应用呢？广泛得很呢！在医学领域，比如早期诊断某些疾病，甚至在食品安全检测中，它都能派上大用场。
就像一个超级英雄，无处不在，保护着我们的健康。
比如说，检测血液中的特定抗体，这可是早发现早治疗的好帮手。
再来聊聊这个方法的优势吧。
敏感度高，能检测到很低浓度的物质，简直是微量分析的好帮手。
时间分辨让结果更加可靠，能够减少假阳性或假阴性的出现，避免了许多不必要的麻烦。
时间分辨荧光免疫技术
食品安全检测
兽药残留检测
该技术可用于检测动物性食品中的兽药残留，如抗生素、激素等，保障消费者健 康和食品安全。
非法添加物检测
可用于检测食品中的非法添加物，如瘦肉精、苏丹红等，保障消费者健康和食品 安全。
环境监测
水质监测
时间分辨荧光免疫技术可用于检测水体中的有害物质，如重金属、有机污染物等，为环境保护提供技 术支持。
技术应用领域
临床医学领域
传染病检测
时间分辨荧光免疫技术可用于 检测乙肝、丙肝、艾滋病等传 染病病毒的抗原和抗体，有助
于早期发现和预防传染病。
肿瘤标志物检测
该技术可用于检测肿瘤标志物，如 癌胚抗原、甲胎蛋白等，有助于肿 瘤的早期发现和预后评估。
免疫系统疾病检测
时间分辨荧光免疫技术还可用于检 测自身免疫性疾病、风湿病、红斑 狼疮等免疫系统疾病的相关抗体。
02
在过去的几十年中，TRFIA技术不断取得突破，如采用纳米材料增强荧光信号 、开发多通道TRFIA等方法，使其在灵敏度、特异性、分析速度等方面得到了 显著提升。
03
目前，TRFIA技术已经广泛应用于临床检验、生物分析、环境监测等领域，成 为一种重要的分析工具。未来，随着技术的不断进步和应用领域的拓展， TRFIA技术有望在更多领域发挥重要作用。
总结词
实时、在线、预警。
详细描述
时间分辨荧光免疫技术还可应用于环境污染物监测， 如水体、土壤和空气中的有害物质监测。该技术能够 实时、在线检测环境中的污染物，及时发出预警，为 环境保护和治理提供科学依据。通过该技术的应用， 能够有效地保护环境和人类健康。
THANKS
感谢观看
Hale Waihona Puke 未来发展趋势与前景随着科学技术的不断进步和生物医学领域的需求不断增长，时间分辨荧光免疫技术将继续得到发展和完善。未来 ，该技术将进一步向着高灵敏度、高特异性、高准确性和低成本的方向发展，以适应更多样化的应用场景和更广 泛的临床需求。此外，随着人工智能和大数据等技术的快速发展，时间分辨荧光免疫技术有望与这些技术相结合 ，实现自动化、智能化和远程化的检测和分析，进一步提高检测效率和精度。
时间分辨免疫荧光法
时间分辨免疫荧光法
时间分辨免疫荧光法（Time-resolved Fluorescence Immunoassay，简称TRFIA），是一种利用荧光信号来检测和
定量分析物质浓度的方法。
TRFIA的原理是基于化学发光现象，通过在分析物上标记荧
光分子作为探针，当样品中的分析物与标记的荧光分子结合时，荧光信号会被激发并发出发光。
与传统的荧光免疫分析方法不同的是，TRFIA利用特殊的化学发光体系，使得荧光信号的
发光时间延长，减少背景干扰信号的影响，从而提高了信号的检测灵敏度和准确性。
TRFIA的优点包括高灵敏度、高选择性、较低背景信号和较
大测量范围等。
它通常被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物监测等领域。
常见的应用包括检测肿瘤标志物、药物残留物、免疫球蛋白等。
总结起来，时间分辨免疫荧光法是一种利用荧光信号进行分析和定量测量的方法，其特点是通过延长荧光信号发光时间，提高信号的检测灵敏度和准确性。
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用
自动化程度高
该技术可以实现自动化检测， 提高检测效率，减少人为误 差。
技术挑战
标记物稳定性
荧光标记物的稳定性对检测结果 的准确性影响较大，需要保证标
记物在长时间内保持稳定。
仪器成本
时间分辨荧光免疫分析技术需要使 用特定的荧光检测仪器，仪器成本 较高，限制了该技术的普及应用。
操作复杂度
相对于其他免疫分析技术，时间分 辨荧光免疫分析技术的操作较为复 杂，需要专业人员进行操作和维护。
临床诊断
临床诊断
时间分辨荧光免疫分析技术可用于临床诊断，特别是对肿瘤、传染病、内分泌等疾病进 行检测和诊断。通过检测患者体内的特异性抗体或抗原，实现对疾病的早期发现和准确
诊断。
临床诊断的应用
时间分辨荧光免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等优点，在临床实践 中得到广泛应用。它可用于检测肿瘤标志物、病毒抗体、激素水平等，为医生提供准确
02
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理
荧光物质
荧光物质
荧光物质是时间分辨荧光免疫分析中的关键成分，通常是一些具有较长荧光寿 命的稀土金属离子或螯合物。这些荧光物质在特定波长的光激发下，能够发射 出波长较长、持续时间较长的荧光信号。
荧光物质选择
选择适当的荧光物质是时间分辨荧光免疫分析技术的关键，需要考虑到荧光的 稳定性、特异性、灵敏度以及与抗原或抗体的结合能力等因素。
可靠的诊断依据。
环境监测
环境监测
时间分辨荧光免疫分析技术也可应用于 环境监测，如水质检测、空气质量监测 等。通过标记环境中的有害物质或污染 物，利用荧光信号的发射和检测，实现 对环境质量的实时监控和评估。
VS
环境监测的应用
时间分辨荧光免疫分析技术可用于检测水 中的重金属离子、有毒有机物、细菌和病 毒等，以及空气中的有害气体和颗粒物。 这有助于及时发现环境污染问题，保障公 众健康和生态安全。
免疫诊断中的时间分辨免疫荧光
免疫诊断中的时间分辨免疫荧光时间分辨免疫荧光（Time-resolved Fluorescence Immunoassays，TRFIA）是一种免疫诊断技术，用于测定生物样品中特定分子的含量。
该技术采用特殊的荧光标记物和时间延迟测量，具有高灵敏度、高特异性和不受背景干扰的优点。
时间分辨免疫荧光技术的基本原理是基于免疫反应和荧光测量。
首先，通过特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）形成免疫复合物。
为了能够测量荧光信号，需要将荧光物质与抗体结合，通常采用标记荧光分子、化学物质（通常是微粒）或金属络合物等。
这些标记物在受到激发光的激发下，会发出荧光信号。
与常规的荧光免疫分析不同，时间分辨免疫荧光技术使用的荧光标记物具有特殊的性质。
它们能够通过时间延迟测量的方式来减少背景信号，从而提高检测的灵敏度和特异性。
常见的荧光标记物有铕、镜铝和镧等稀土金属离子，它们具有长寿命的激发态，可以通过时间延迟测量的方式来区分免疫复合物产生的荧光信号和背景信号。
时间延迟测量的原理是基于不同荧光物质的发光寿命差异。
荧光信号的发射通常分为两个过程：吸收光子激发荧光物质的电子跃迁到高能级激发态，然后激发态的电子从高能级返回到基态并发出荧光信号。
荧光物质的发光寿命通常以纳秒（ns）为单位。
由于荧光物质的发光寿命较长，背景信号的发光寿命较短，可以通过延迟测量的方式来区分二者。
在时间分辨免疫荧光分析中，荧光标记物所产生的发光信号会在光学传感器中被捕获。
传感器通常包括发光源、示波器和检测器。
发光源会提供一个特定波长的激发光，使荧光标记物发射荧光信号。
示波器会记录发光信号的强度和时间，检测器则用于测量发光信号的时间延迟。
时间分辨免疫荧光技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
它可以快速、准确地测定生物样品中各种生物分子的含量，如抗体、抗原、蛋白质、细胞因子等。
该技术在癌症筛查、感染病毒检测、药物代谢和药物疗效监测等方面具有重要的临床应用。
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以镧系元素铕（Eu3+）等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
镧系元素铕（Eu）、钐（Sm）、铽（Tb）和钕（Nd）通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
镧系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出镧系离子，然后与荧光增强液中的β-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强镧系荧光免疫分析（dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay，DELFIA）。
镧系元素的发光时间延长，如Eu3+和Sm3+的荧光衰变时间分别达到4.3×105ns和4.1×104ns，而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4—10ns，通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，镧系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成（一）Eu3+标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4℃或-20℃保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
（二）固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
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一、前言
近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。
所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。
事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。
20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。
正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。
抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。
免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。
时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。
它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。
正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。
二、时间分辨荧光免疫分析的原理
时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。
当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。
正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。
后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。
采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。
三、时间分辨荧光分析的测量方法
（1）解离增强测量法
解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。
通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。
最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+
从免疫复合物中解离下来，组成Eu3+-(NTA)3.(TOPO)3或Sm3+-(NTA)3.(TOPO)3新的螯合物，使荧光强度增强将近百万倍。
用Arcus型系列仪进行液相检测。
本法重复性好，特别适用于大、小分子活性物质的检测。
采用DELFIA测量，灵敏度可达10-16—10-18mol的DNA量（即10pgDNA）。
此法的不足之处是不能直接测量固相样品的荧光，需要外加增强液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干扰，而影响结果，有待改进。
（2 ）固相荧光测量法
固相荧光法又称为DSLFIA法。
它是通过具有特殊双功能基团的螯合剂BCPDA，把Eu3+或Sm3+与抗体或抗原螯合。
当抗原与抗体发生免疫反应后，固相免疫复合物中Eu3+-BCPDA荧光强度可直接测量。
整个过程不用外加增强液，可以直接测量固相样品的荧光，解决了液相测量带来易于污染和操作复杂的问题。
现已用于核酸探针检测，取得满意进展，国外已制成药盒供应。
（3）直接荧光测量法
直接荧光法是采用双功能螯合剂二乙三胺五乙酸-对氨基水杨酸（DTPA-PAS）与抗原或抗体偶联，免疫反应后，再加入适量的Tb3+，直接测量液相荧光强度。
不需要预先制备Tb3+标记物，简化了操作步骤，但灵敏度较低，仅为10-9mol/l。
为提高检测灵敏度，可以引入酶放大系统，以SA-碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯，生成5-氟水杨酸，后者在高pH条件下，与Tb3+-EDTA-HCl形成高荧光强度的复合物，可直接测定。
（4）均相荧光测量法
均相荧光测量法是利用特殊的双功能螯合剂W1174，将Eu3+标记小分子活性物质，当与抗体结合后，免疫复合物对Eu3+荧光信号有显著增强或淬灭作用，故在测量前不必进行分离，就可直接测量液相中的荧光强度。
该法省去了洗涤、分离和加增强液等烦琐的步骤，具有快速、方便等优点，但不足之处是需要特殊螯合剂。
（5）协同荧光测量法
协同荧光测量法是利用一些不发荧光的稀土离子，如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等，能使发荧光的稀土离子的荧光信号大大增强。
在免疫分析体系中，pH值为6.0-8.0时，它们的荧光强度最大，有利于提高检测的灵敏度。
此外，此法可以对一分样品中不同组分含量进行同时测量。
但需要特殊的增强液，同时Cd3+、Y3+、La3+、Lu3等稀土离子的纯度对测量结果有明显影响。
四、时间分辨荧光免疫分析的应用
时间分辨荧光免疫分析可用来检测生物活性物质，特别是在生物样品免疫分析中，显示出它愈来愈多的独特优点。
在内分泌激素的检测，肿瘤标志物的检测，抗体检测，病毒抗原分析，药物代谢分析以及各种体内或外源性超微量物质的分
析中，应用TRFIA法越来越普遍。
近年来，已将这项技术应用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分子分析，发展十分迅速。
（1）TRFIA法在内分泌学中的应用
内分泌激素是一些活性小分子，它们能与适当的抗体反应，具有免疫反应性，但不能产生抗体，不具有免疫原性，它们属于半抗原。
对这些半抗原的测定，一般多用竞争性时间分辨荧光免疫法测定。
这方面的测定主要有血清中孕酮[3]、雌二醇[4]、睾酮[5]、甲状腺激素[6]、前列腺素[7]的测定等等。
（2）TRFIA在肿瘤学中的应用
对一些完全抗原，它们大多是既有免疫反应性又有免疫原性的蛋白质类，主要包括促甲状腺激素[8]、血清胰岛素[9]、血清癌胚抗原[10-11]、血清甲胎蛋白[12]、乙型肝炎表面抗原[13]等，主要采用非竞争性TRFIA法进行测定。
（3）TRFIA法在免疫学中的应用
某些免疫细胞（如NK、LAK、T杀伤细胞等）的活性，可以用TRFIA法来检测。
如Blomberg[14]等用该方法测定了NK细胞的活性；Granberg[15]等用TRFIA法测定杀伤性T淋巴细胞活性；Volgmann[16]等测定了LAK细胞的活性；Maley[17]用TRFIA法测定细胞介导的、补体介导以及抗体依赖的细胞活性；Lovgren和Blomberg[18]用此法同时测定两种靶细胞的活性；陈泮藻[19]等也用此法测定了T 淋巴细胞的活性。
这些测定均取得了良好的结果。
（4）TRFIA法在微生物学中的应用
由于TRFIA技术具有灵敏度高和特异性强的特点，TRFIA法在微生物检测和分析中的应用日益广泛和深入。
目前TRFIA已广泛应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒（RSV）、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测[2]。
最近,潘利华[20]等用TRFIA法进行了人血清中丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)的检测，效果明显高于酶联免疫法。
五、展望
时间分辨荧光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点，是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法。
有关研究论文约占免疫分析文献的10%-15%。
寻找、设计并合成出较理想的镧系元素螯合物探针；改进标记技术和简化分离技术；采用多重标记法进行放大，进一步提高灵敏度以及提高检测手段的程序化，进一步提高信噪比将成为时间分辨荧光免疫分析的发展方向。