模拟酶人工酶
酶的人工模拟或模拟酶
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应 速度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中 的Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化 为下式：
第一节 酶促反应动力学
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下， 其Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
一般说来，模拟酶是在分子 水平上模拟酶活性部位的形状、 大小及其微环境等结构特征，以 及酶的作用机理和立体化学等特 性的一门科学。
模拟酶的研究就是吸收酶中 那些起主导作用的因素利用有机 化学、生物化学等方法，设计和 合成一些较天然酶简单的非蛋白 分子或蛋白质分子，以这些分子 作为模型来模拟酶对其作用底物 的结合和催化过程。
图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系
第一节 酶促反应动力学
1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten）在前人工作的基础上， 通过大量的定量研究，提出了酶促动力学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方 程，推导过程如下：
模拟酶的分类
模拟酶的分类摘要：模拟酶又称人工合成酶，是一类利用有机化学方法合成的比天然蛋白酶分子简单的非蛋白质分子。
酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。
研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。
模拟酶是20世纪60年代发展起来的一个新的研究领域，是仿生学一个重要内容。
1、根据Kirby分类法1.1 单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性1.2 机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成1.3 单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子2、按照模拟酶的属性2.1 主-客体酶模型2.1.1环状糊精酶模型环状糊精（简称CD）是由多个D-葡萄糖以1，4-糖苷键结合而成的一类环状低聚糖。
根据还原糖数量的不同，可分为六个，七个及八个环状糊精三种，他们均是略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大的开口端。
这样CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键，其内侧C上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，故具有疏水性，因而能包容多种客体分子，很类似酶对底物的识别。
作为人工酶模型的主体分子虽有若干种，但环状糊精是迄今应用最广泛且较优越的主体分子。
环状糊精酶模型又可分为水解酶的模拟，转氨酶的模拟，核糖核酸酶的模拟，桥联环状糊精模拟酶模型。
2.1.2 合成的主-客体酶模型主客体化学与超分子化学的迅速发展极大地促进了人们对酶催化的认识，同时也为构建新的模拟酶创造了条件。
除天然存在的宿主酶模型，人们合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体用来构筑酶模型。
2.2 胶束模拟酶胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物进行束缚。
如果将催化基团如硫醇基、羟基和一些辅酶共价或非共价的链接或吸附在胶束上，就有可能提供活性中心部位，使胶束具有成为酶活力的胶束模拟酶。
第七章化学人工酶和酶的非水相催化解析
1983年，Rupley等人从溶菌酶的结论得知，一个 干燥蛋白的水合过程经过4个步骤： (1)加入的水首先与酶分子表面的带电基团结合， 达到每克蛋白质0~0.07g水。 (2)然后与酶分子表面的极性基团结合(每克蛋白 质0.07~0.25g水)。 (3)多出来的水再凝聚到蛋白质分子表而相互作 用较弱的部位(每克蛋白质0.25~0.38g水)。 (4)最后，酶分子表面完全水化，被一层水分子 所覆盖(每克蛋白质0.38g水，大约300个水分子)。
第二节 非水介质中的酶催化反应
1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首 次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催 化行为及热稳定性的研究报道，引起了 广泛的关注。传统的酶学领域迅速产生 一个全新的分支非水酶学。 现在非水酶学方法在多肽合成、聚 合物合成、药物合成以及立体异构体拆 分等方面显示出广阔的应用前景。
一、半合成酶
半合成酶 将具有一定结构和功能的物质与特异的 蛋白质结合，便可形成新的生物催化剂—— 半合成酶。
一、半合成酶
1．将具有催化活性的金属或金属有机物与 具有特异性的蛋白质相结合，形成半合 成酶。 Gray与Margalit将电子传递催化剂 [Rn(NH3)5]3+，与巨头鲸肌红蛋白结合， 产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传 递氧气， Rn(NH3)5]3+能氧化各种有机物 (如抗坏血酸)。这种人工酶的催化效率是 钙一咪唑复合物的200倍，接近天然的抗 坏血用人工方法合成 具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一个八肽具有溶菌酶的活 性。
三、设计要点
设计前： 酶活性中心-底物复合物的结构 酶的专一性及其同底物结合方式的能力 反应的动力学及各中间物的知识
三、设计要点
设计中： 为底物提供良好的微环境（疏水性） 应提供形成离子键、氢键的可能性，以利 于结合底物 催化基团必须相对于结合点尽可能同底物 的功能团相接近 应具有足够的水溶性，并在接近生理条件 下保持其催化活性
抗体酶
1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC） 作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。 诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
抗体酶
抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalytic antibody)是抗体的高度选择性和酶的高效 催化能力巧妙结合的产物。
本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋
过渡态理论
过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个 易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应 所需的活化能。
与反应过渡状态结合作用
在酶催化的反应中，与酶的活性中心形 成复合物的实际上是底物形成的过渡状 态， 酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物 或产物的亲和力。
抗体酶设想
1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度 特异性，与天然酶结合底物的高度专一 性相类似的特性，在过渡态理论的基础 上首先提出设想：
10.1 模拟酶
11.1.1 模拟酶的概念
模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子 水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微 环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体 化学的一门学科，是从分子水平上模拟生物 功能的一门边缘学科。
模拟酶是20世纪60年代发展起来的一个新的研 究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。
–酶的作用机制：过渡态理论
–对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究
• 超分子化学
– 主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及 电子排列的互补
– 超分子：该分子形成源于底物和受体的结合， 这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与 络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结 构和性质的实体，形成超分子 – 功能：分子识别、催化、选择性输出
白，在
其可变区赋予了酶的属性。 它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研 究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化 能力巧妙结合的产物。
人工模拟酶
分子印记技术是在分子识别基础上开展的。 分子印记技术是在分子识别基础上开展的。
分子识别本质上是指主体分子(受体)对客体分子 分子识别本质上是指主体分子(受体) 本质上是指主体分子 (底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程。如： 底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程。 酶与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。 酶与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。
互作用力形成稳定复合物的化学领域。 互作用力形成稳定复合物的化学领域。
超分子化学： 超分子化学：研究两种或两种以上的化学物通过分子间力
（静电作用、氢键、范德华力等非共价键）相互作用缔结而成 静电作用、氢键、范德华力等非共价键） 的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。 的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。
杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差， ④ 杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差，但通过衍 生化后，某些衍生物具有很好的溶解性； 生化后，某些衍生物具有很好的溶解性； ⑤ 杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物，这是集冠醚 杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物， 和环糊精两者之长； 和环糊精两者之长； 杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品， ⑥ 杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品，事实上现 在已有多种杯芳烃商品化。 在已有多种杯芳烃商品化。
胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用， 胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用，使酶 活性呈现“超级活性” 另一方面， 活性呈现“超级活性” 。另一方面，利用胶束介质 尤其是反相胶束介质） （尤其是反相胶束介质）模拟天然酶在生物体内活体 细胞中的微环境。 细胞中的微环境。
X X X X X X X X X
（2）胶束酶
人工酶
分子印迹酶
印迹底物及其类似物
• 将 4(5)-乙烯基咪唑聚合可以得到一种模
拟氨基酸酯水解酶的印迹聚合物，可选
择性水解与印迹分子结构相关的氨基酸 酯底物 [N-Boc-氨基酸对硝基苯酯]
• 由于底物在单体聚合时可能发生水解，
因此用其结构类似物 [N-Boc-氨基酸-2吡啶甲酰胺] 为印迹分子 • 聚合后抽提除去模板，在聚合物孔穴内 的特定距离位置留下咪唑基（聚合物骨 架），能起到催化基团的作用
分子印迹酶
什么是“分子印迹酶（molecular imprinting enzyme）”？
• 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底
物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生 催化基团，并与底物定向排列
• 分子印迹酶面临的最大挑战之一是如何利用分子印迹技术来模
拟复杂的酶活性中心部位，使其最大限度地与天然酶相似，即 选择合适的印迹分子是关键的一环 – 底物 – 底物类似物 – 酶抑制剂 – 反应过渡态类似物
• 维生素 B6 通常以磷酸化的形式参与转氨酶的催化反应
• 维生素 B6 自身即能实现转氨基作用，但缺乏底物结合位点， 高效的转氨酶模型必须具有合适的底物结合部位，环糊精的空 腔能够为底物提供良好的结合位点 • 1980 年报道了第一个人工转氨酶模型，它具有良好的底物选 择性，可以使反应加速 200 倍
分子印迹酶
印迹过渡态类似物
• 利用分子印迹技术印迹磷酸单酯（充当
酯水解过渡态类似物），通过与含脒基 （催化部位）的功能单体结合，形成稳 定的复合物。此印迹酶表现出很强的酯 水解活性 • 适当地设计模板分子和催化基团，将稳
N H O N H O CH3 N H O P N H O O CH3
酶工程第二版部分重要名词解释
就是根据酶的作用原理，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些比天然酶以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催抗体酶又称催化抗体，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物定点突变（sited-directed mutagenesis, SDM）：是指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性等.核酶：是一类具有酶特性的RNA分子，它通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂破坏mRNA的状态，从而阻断该基因的表达。
酶定向进化：模拟自然进化过程，如随机突变和自然选择，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊坏境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。
生物传感器：利用一种能与换能元件在空间上直接接触的生物识别元件提供特殊的定量或半定量的分析信息的完整综合装置。
等密度梯度离心：当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒在沉降或者漂浮时，经过足够长的时间久可以移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带，这种方法叫做等密度梯度离心。
酶工程：是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。
酶的活性中心(active center) ：是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
酶活力：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。
所以测定酶的活力就是测定酶的反应速率。
酶的比活力:代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。
5第五章人工模拟酶
- SH H+
ROOC NH O=C O O NO2
R O O=C CH2
HOOC :N
β-Benzyme对于对-叔丁基-苯基乙酸酯 (p-NPAc)水解活性比天然酶高1倍以上， kcat/Km(底物专一性)也与天然酶相当， Bender因此闻名于世。
NH
HO
S
OH
β-Benzyme
组氨酸咪唑基是十分有效的酸碱催化剂和亲核催化剂，在水解酶活性 中心起关键性催化作用。
OH O C=C ODEAE NH2 NH DEAE
CD环包结呋喃环-识别定向
O O O C=C O O
糠偶酰 烯醇-O-与Cu2+静电或配位结 合得以稳定加速反应进行。
Cu2+
NH NH2
催化基团 催化活性中心
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC.1.11.1.9)为含硒酶，是生物体内重要 的抗氧化酶，能有效消除体内的自由基，与超氧化物歧化酶和过氧 化氢酶共同作用，防止脂质过氧化。因此GPX在治疗和预防克山病、 心血管病、肿瘤等疾病具有明显的疗效。该酶来源非常有限，而且 稳定性差，分子量大等限制了它的实际应用。 利用CD的疏水腔作为底物结合部位，硒巯基为催化部位，制备出系列 双硒侨联环糊精。表现出很高的GPX酶活性，其中C2和 C6-硒化环糊精 的GPX活力已达到4.3U/µmol和7.4 U/µmol。若将C2-硒化环糊精改变成碲 化环糊精的GPX活力已达到45U/µmol。
第七章酶的模拟
52%
策略：
一系列端基为咪唑基、羧基、羟基或氨 基的长链化合物溶于水，形成“簇”， 每个簇为一多组分混合体系，每一个组 分含有一个潜在的催化基团，可与相邻 的催化基团协同作用。
五、抗体酶（Abzyme） 又称催化抗体（catalytic antibody）
理论基础：过渡态理论。
制备方法： 1.过渡态类似物设计
1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应 的羧酸二酯的过渡态类似物。
诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
利用过渡态类似物制备抗体酶
③ 从聚合物中除掉印迹分子。
2．分子印迹酶 印迹底物及其类似物 印迹过渡态类似物
3．生物印迹酶 利用配体诱导酶活性中心构象发生变
化，形成一种高活性的构象形式，此种 构象形式因酶在有机介质中的高度刚性 或通过交联固定而得到保持。
有机相生物印迹酶 水相生物印迹酶
枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂的水溶液 中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷 中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液 中冻干出来的酶高100倍
cavity
பைடு நூலகம் 1． 水解蛋白酶的模拟
利用β-CD作为酶的结合部位，而连在其 侧链上的羧基、咪唑基及CD本身的一个 羟基共同构成催化中心，实现了胰凝乳 蛋白酶的模拟。
组氨酸咪唑基的引入
2．核糖核酸酶的模拟
催化基团所处的位置可对反应的选择性 起作用。
碱性条件下水解，同
时产生Ⅱ和Ⅲ两种产 物，而在A的催化下 水解只生成Ⅲ； B催 化水解反应只生成Ⅱ。
酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
根据Kirby分类法 单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性
机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的
认识
来指导酶模型的设计和合成
单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单
三、模拟酶的分类
按照模拟酶的属性分类 主-客体酶 胶束酶 肽酶 半合成酶 分子印迹酶
用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶等多种酶。
一、模拟酶
人工酶（artificial enzyme）
人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白质。
人工合成的 Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe 八肽具有溶菌酶的活性 。其活性为天然溶菌酶的50%。
二、模拟酶的理论基础
1. 模拟酶的酶学基础
酶的作用机制 — 过渡态理论 对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究
二、模拟酶的理论基础
2. 主-客体化学和超分子化学
主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补
超分子化学：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非
共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形 成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，
三、模拟酶的分类
分子印迹酶
通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底 物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化 基团，并与底物定向排列。
性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。
三、模拟酶的分类
生物印迹酶
生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上 进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程
三、模拟酶的分类
5. 印迹酶
第六章 酶的人工模拟
2.催化效率的问题
催化抗体实用化的关键问题：
催化效率
目前大部分催化抗体的反应速度加强只 能是中等水平的，比天然酶催化低2～3 个数量级
第三节 印迹酶
一.分子印迹技术概述
1.分子印迹原理
分子印迹（Molecular imprinting）是制备对某 一化合物具有选择性的聚合物的过程。
肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合 成的具有催化活性的多肽。 设计合成29肽TrPepz模拟了胰蛋白酶的 活性部位，在水解2个或2个以上串联的 赖氨酸和精氨酸残基的化学键时， TrPepz比胰蛋白酶的活性更强。
三.半合成酶
以天然蛋白或酶为母体，用化学或生物 学方法引进适当的活性部位或催化基团， 或改变其结构从而形成一种新的“人工 酶”。
抗体：即免疫球蛋白。机体的免疫系统因外来
的入侵而产生的保护性分子，它能与抗原特异 地结合。
单克隆抗体：单一克隆产生的并对某种抗原具
有特异性的均一性抗体，它可通过单克隆抗体 技术（即杂交瘤技术）人工制备。
2、历史
1.1948年Pauling的预言： 酶的催化作用是由于酶在催化化学反应过 程中，活性中心同底物的过渡态或高能 反应中间体产生互补，从而加速化学反 应的进行。
1962年首次合成的冠醚形状似皇冠而得名：
命名
子数
x－冠－y：x——环上的原子总数，y——氧原
15—冠—5
18—冠—6
日本学者Koga等 人采用冠醚为主 体，合成了带有 巯基的仿酶模型。 利用此模型可在 分子内实行“准 双分子反应”以 合成多肽。此模 型具有结合两个 氨基酸的能力。
二.胶束模拟酶
2. 超分子化学
主-客体”化学(host-guest chemistry)
人工模拟酶技术的研究与应用_邢锦娟
第29卷第2期 辽宁工业大学学报(自然科学版) V ol.29, No.22009年 4 月 Journal of Liaoning University of Technology(Natural Science Edition) Apr.2009收稿日期：2008-12-12作者简介：邢锦娟(1980-)，女，山西原平人，助理实验师。
人工模拟酶技术的研究与应用邢锦娟，刘 琳（渤海大学 应用化学省级重点实验室，辽宁 锦州 121003）摘 要：人工模拟酶是为了顺应克服传统酶对热敏感、稳定性差、来源有限以及催化条件局限性等缺点的需要，而研制和开发的一种新型催化剂。
简要地概述模拟酶研究的理论基础，并分别从小分子仿酶体系，大分子仿酶体系，以及当今的研究热点抗体酶等几个方面对人工模拟酶模型的研究进展作了简要介绍。
关键词：模拟酶；主-客体化学；超分子化学理论；分子印迹；催化抗体中图分类号：O621.25 文献标识码：A 文章编号：1674-3261(2009)02-0125-04Research and Application of Artificial Enzyme TechnologyXING Jin-juan ，LIU Lin（Provincial Key Laboratory for Applied Chemistry, Bohai University, Jinzhou 121003, China ）Key words: enzyme; main-object chemistry; supramolecular chemistry; molecular imprinting;catalytic antibodiesAbstract: Artificial enzyme was a new type of catalyst developed and researched, which overcame the shortcomings such as the traditional heat-sensitive, poor stability, the limited sources, as well as the limitations of the conditions. Theoretical basis in research was briefly outlined, respectively from the aspects of small molecules, large molecules like-enzyme system, as well as the present burning points in antibody enzyme research, the research progress of artificial enzyme model was briefly described.酶是自然界经过长期进化而产生的一种生物催化剂，它具有催化效率高、作用专一性强和反应条件温和等显著特点。
模拟酶
分子印迹
聚合物中产生呢？ 如果以一种分子充当模板，其周围用聚合 物交联，当模板分子除去后，此聚合物就 留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建 合适，这种聚合物就像‘‘锁”对钥匙具 有选择性识别作用一样，这种技术被称为 分子印迹技术。
分子印迹 所谓分子印迹(molecular imprinting) 是制备对某一化合物具有选择 性的聚合物的过程，这个化合 物叫印迹分子(print molecule，P)， 也叫做模板分子(template，T)。
非水相生物印迹酶制备示意图
在有机相中,生物印迹蛋白质由于保
持了对印迹分子的结合构象而对相 应的底物产生了酶活力， 那么这种构象能否在水相中得以保 持，从而产生相应的酶活力呢？
水相生物印迹酶
研究结果表明，采用交联剂完全可以固
定印迹分子的构象，在水相中产生高效 催化的生物印迹酶。利用这种方法已成 功地模拟了许多酶(如酯水解酶、HF水 解酶、葡萄糖异构酶等)，有的甚至达到 了天然酶的催化效率。
种作用力，且键的数目又多，可大大改善聚合物的识 别能力。
③ 交联剂的类型和用量：交联少会减低聚合物的坚
固程度，难于限定负责选择性部位的形状和其中的基 团取向，导致识别力下降。使用旋光性交联剂，则可 能造成与模板分子有附加的手性相互作用，提高识别 力。
④ 聚合条件：低温聚合较好
印记分子的优点和局限性
还是大分子(如蛋白质等)已被应用于各种印迹 技术中。
2 固相萃取
通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分
子印迹技术的出现，这可以用固相萃取代替，
并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分 析物。由于印迹聚合物即可在有机溶剂中使用， 又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比， 具有独特的优点。
人工酶
印记分子：酶的抑制剂、底物类似物、过渡态类似物等。 由这些分子印记出来的MIP具有酶的性质。
原理：生物材料在水中有柔性，可通过氢键等作用和印 记分子很好识别，形成新的特定构象；此构象在无水有 机溶剂中可得到保持。除掉印记分子的生物材料的构象 再回到水中时，特定构象破坏。 做法：在水溶液中让印记分子和生物材料充分接触，形 成复合体。然后将复合体冷冻干燥。脱除印记分子后， 便得到生物印记酶。
羟基伸出筒口，故外侧亲水， 可与多种客体形成氢键；内腔 疏水，能包结多种客体分子 ( 类 似酶识别底物)。
环糊精和底物结合常数小于酶， 修饰后可达到酶和抗体的结合 水平。
修饰环糊精1－水解酶的模拟
A：在环糊精引入酰基酶催 化部位，酯 ( 叔丁基苯基乙
酸酯)水解能力提高1倍。
B：引入咪唑基，酯水解能 力高一个数量级(10倍)。
修饰环糊精3-转氨酶的模拟
转氨酶：催化酮酸和氨基酸之 间的转氨。
吡哆胺：转氨酶辅酶，单独可 转氨，不如酶存在时快。
A ：多了一个吡哆胺，转氨反 应快 200 倍，同时因 CD 具手性， 产物氨基酸有D、L两种构型。 B ：又多了乙二胺，催化速度 又提高 2000 倍。且立体选择性 更强(乙二胺附近质子转移受抑 制 )。
此化合物可催化 ATP水解为 ADP和 AMP。pH 7时水解 提速500倍。
-胰凝乳蛋白酶模拟
A ： - 胰凝乳蛋白酶模拟物， 是含 B 的具有孔隙状结构的 球状配体，由环状尿素连接
而成的孔穴状结构，方便与
底物结合。 B ：催化底物进行酰基转移
反应的亲核试剂。
A催化底物反应的速度是B的 1011 倍。
第六章
人工酶
天然酶的特点:
人工酶专业知识讲座
2. 水相生物印迹
（1）酯水解生物印迹酶
1984年，Keyes等首例用这种措施制备旳印迹酶。
印迹分子：吲哚丙酸，
印迹牛胰核糖核酸酶，
待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸作用， 用戊二醛交联固定印迹蛋白质旳构象． 透析清除印迹分子 制得了具有酶水解能力旳生物印迹酶。
特点：
印迹酶粗酶具有7.3U/g，而非印迹酶则无酯水解酶活力。 粗酶经硫铵分级纯化后，比活力增至22U／g。 再经柱层析纯化后，出现 3种交联组分，其中低分子量组分显示
模拟α－胰凝乳蛋白酶活性部位 模拟胰蛋白酶旳活性部位，
水解蛋白旳活力分别与其模拟旳酶相同
三、半合成酶 以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物
学措施引进合适旳活性部位或催化基团，或变 化其构造从而形成一种新旳“人工酶”。
1、选择性修饰氨基酸侧链（化学诱变法） Bender等首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活
第六章 人工酶
第一节 人工酶旳理论基础和策略
经过对生物体系旳构造与功能旳研究, 为设计和建造新旳技术提供新思想、新 原理、新措施和新途径。
利用化学模拟作为阐明自然界中生物体 行为旳基础。人们认识到研究和模拟生 物体系是开辟新技术旳途径之一。
一、人工酶概念：
人工酶是在分子水平上模拟酶活性部位 旳形状、大小及其微环境等构造特征， 以及酶旳作用机理和立体化学等特征旳 一门科学。
二、人工酶旳理论基础
1、人工酶旳酶学基础
➢酶是怎样发生效力旳？
Pauling 旳 稳 定 过 渡 态 理 论 ： 酶 先 对 底物结合，进而选择性稳定某一特定反 应旳过渡态（TS）,降低反应旳活化能， 从而加紧反应速度。
广义旳酸碱催化、邻近与定向、变形与 张力等等，都是酶催化高效性旳主要原 因。
第六章-人工模拟酶03
但由于它是由化学合成方法所制备的，因此又 具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能 力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。
（二）分子印迹发展的基本趋向：
（1）预组装方式： 印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，
聚合后再打开共价键去除印迹分子。 印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，如
目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、 美国、中国在内的10多个国家、100个以上的学术 机构和企事业单位在从事这一技术的研究与开发。
模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富 挑战的课题。
二、分子印迹技术的原理与特点
• 分子印迹技术的原理 当模板分子（印迹分子）与带有官能团的单
体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重 作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来， 当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板 分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部 位，这样的结合部位对模板分子可产生相互作用 ，因而对以此模板分子具有特异的结合能力。
构建模拟酶的酶模型分子：环糊精、 穴醚、卟林等。
模拟酶的理论基础
1. 酶的作用机制： 过渡态理论
2 人工系统研究 对简化的人工体系中识别、结合和催化
3 主客体化学： 主体和客体在结合部位的空间及电子排列
的互补。配位键或其他次级键连接。 4 超分子化学：
该分子形成源于底物和受体的结合，这种 结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合 离子或分子结合形成具有稳定结构和性质的实 体，形成“超分子”。
硼酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯等，所采用的 单体通常是低分子的化合物，此单体与印迹分子形 成的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合 后又能完全脱除。
特点：空间位置固定准确，能够移走大量的印迹 分子。但是，对携带适当结合基团的化合物选择性 低。
酶工程名词解释
名词解释：化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括3个方面：用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)；修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)；设计新的酶基因合成自然界不曾有的新酶蛋白质的四个结构水平：一级结构、α—螺旋结构、三级结构、四级结构1.固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
2.固定化细胞:细胞受到物理化学等因素约束或限制在—定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。
固定化酶(细胞)的活力：即是固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。
活力回收：是指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分数。
偶联率=(加入蛋白活力—上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100％活力回收=固定化酶总活力／加入酶的总活力×100％相对活力=固定化酶总活力／(加入酶的总活力—上清液中未偶联酶活力) ×100％固定化酶(细胞)的半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。
酶的化学修饰是指用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，从而达到改变酶的催化性质及一些生理生化性质的目的。
交联剂：是具有两个反应活性部位的双功能基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。
交联剂分为:◆同型双功能试剂、◆异型双功能试剂◆可被光活化试剂3种类型，每类中又分；◆为可裂解型◆不可裂解型。
交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。
第七章 化学酶工程-人工模拟酶
要“超分子”。
7.2.3 模拟酶的分类
主-客体模拟酶 胶束酶
肽酶
分子印迹酶
（1）主-客体模拟酶
环糊精模拟酶 合成的主-客体酶
天然存在的、类似酶的理想宿主分子，本身具有酶模型的特性。 略呈锥形的圆筒结构：外侧亲水，内侧的空腔具有疏水性。
其特殊结构使环糊精分子能够作为主体识别并捕捉匹配的客体
设计合成的以冠醚环和巯基为主体分子的冠醚模拟酶：
杯芳烃
1942年金克(Zinke，奥地利)首次合成得到，因其结构像一个酒 杯而被称为杯芳烃。
绝大多数的杯芳烃熔点较高，在250℃以上。
其上端由取代基组成，下端酚羟基。（其上部亲油，下部亲水， 可分别与疏水性分子、极性离子结合） 杯芳烃具有大小可调节的“空腔”，能够形成主-客复合物，与 环糊精、冠醚相比，是一类更具广泛适应性的模拟酶，是继冠 醚和环糊精之后的第三代主体化合物。
的聚合物内保留与印迹分子的形状、大小、功能团互补的 空穴； 后处理：成型加工和真空干燥。
五、影响分子印迹选择性识别的因素
底物结构和印记分子的一致性：底物必须与印记分子的结
构、大小相似，否则影响分辨率。
聚合物与印记分子之间的作用力：作用力是影响分辨率的
重要因素，若能产生多种相互作用力，且键的数目又多，则分辨
在人工酶的研究中，印迹被证明是产生酶结合
部位最好的方法。
2、分子印迹酶
选择的印迹分子有：
① 印迹底物、产物、底物类似物：
② 印迹过渡态类似物：
③ 表面印迹过渡态类似物：
通过分子印迹技术，印迹后的聚合物除了可产生底物的 结合部位之外，重要的是在结合部位的空腔内诱导产生 与底物定向排列的催化基团，从而表现出酶的性质。 性质：遵循米氏方程。
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• 将乙二胺与CD偶联，然后与Cu盐作用形成桥连 环糊精。
• 含镍的水杨酚CD复合物A、B，对一些特殊结构 的三肽化合物有显著的选择结合能力,用于肽库中 筛选特异性小肽。
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• 胡萝卜素氧化酶的模拟： 含卟啉的桥连CD，金属卟 啉能催化双键，可以选择 性氧化C15=C15‘键。
• 合成的复合物对底物胡萝 卜素的结合远大于产物视 黄醛。
模拟酶的介绍
• 一.主、客体酶的模型 • 天然宿主：CD • 合成主体：冠醚、穴醚、杂环大分子化合
物、卟啉类
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主、客体酶的模型
• （一）环糊精酶模型 • 环糊精是环状低聚糖
的总称。其中研究得 最多的是环糊精。 • 环糊精是由6个葡萄 糖分子按照14连接 方式形成的一种环状 结构天然淀粉，并具 有园柱型立体结构特 点。
• CD底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置 对选择性起了决定性作用。最佳pH6：一个咪唑 基以碱的形式，另一个咪唑基以质子化形式参加 反应，与天然酶相似。
3.转氨酶的模型：
• 磷酸吡哆醛（胺）是转氨酶的辅酶，最重要的反应是酮酸 与氨基酸的转换，转氨反应机理.
• 没有酶存在时，磷酸吡哆醛（胺）也能实现转氨作用，但 反应极慢，其无任何选择性。原因在于辅酶本身无结合部 位，不能形成酶-底物络合物，后者是酶反应必不可少的 环节。
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水解酶模型
• A:β-Benzyme,水解叔丁基苯基乙酸酯（p-NPAc）比天 然酶快1倍。
• B：咪唑直接与CD连接，比天然酶催化速度快1个数量级。 • C：增加CD对底物过渡态的结合能力：修饰底物增加，底
物与CD的结合，如用二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基 苯酯,CD作为催化剂加速水解大105-106倍。
模拟酶的理论基础和策略
• 模拟酶的概念 • 吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、
生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的 非蛋白质或蛋白质分子，以这些分子作为模型来 模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。 • 由此可见，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部 位的形状、大小及微环境等结构特征，以及酶的 作用机理和立体化学等特异性的一门科学。 • 一方面基于酶的作用机制，另一方面基于对简化 的人工体系中识别、结合和催化。
• 超分子化学：超分子起源于底物和受体的结合， 基于非共价健的相互作用，如静电作用、氢键、 范德华力等。当接受体和络合离子或分子结合成 稳定的、具有稳定结构和性质的实体，即“超分 子”，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功 能。
• 主客体化学、超分子化学是酶人工模拟的重要理 论基础。根据酶催化反应机理，若能合成出能识 别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子， 就能有效地模拟酶的催化过程。
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• 2.核糖核酸酶模型 • 核糖核酸酶具有2个组氨酸咪唑基及1个质
子化赖氨酸基处于活性中心。 • 在它的催化下RNA的磷酸酯水解分为两步
进行，两个咪唑基交替起到一般酸或碱的 催化作用，使离去基团质子化或增加亲核 基团的亲核性。
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• Breslow等人设计了2种核糖核酸酶模型：A、B， A催化只生成III，B催化只生成II。
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• 模拟酶可分为：根据Kirby分类法 • （1）单纯酶模型：即以化学方法通过天然
酶的活性模拟来重建和改造酶的活性。 • （2）机理酶模型：即通过对酶作用机制诸
如识别，合成。 • （3）单纯合成的酶样化合物：化学合成的 具有酶样催化活性的简单分子
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• 按照模拟酶的属性，可分为： • ①主客体酶模型 • ②胶束酶模型 • ③肽酶 • ④抗体酶 • ⑤分子印迹 • ⑥半合成酶。
设计要点
• 设计模拟酶前，酶的结构和酶学性质的 深入了解：
• （1）酶活性中心-底物复合物的结构、 • （2）酶的专一性及其桶底物结合的方
式和能力、 • （3）反应的动力学及各中间物的知识。
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设计要点
• 设计人工酶模型应该考虑的因素： • （1）非共价键相互作用是生物酶柔韧性
可变性和专一性的基础，故酶模型要为底 物提供良好的微环境； • （2）催化基团必须相对于结合点尽可能 同底物的功能团相接近，以促进反应定向 发生； • （3）模型应该具有足够的水溶性，并在 接近生理条件下保持其催化活性。
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2．环糊精结构示意
• 外侧亲水，OH可与多种客体形成氢键。 • 内侧C3C5的H和糖苷O组成的空腔，疏水性，能
包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。
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• 介绍几种水解酶模 型
• 1.水解酶模型 • α-胰蛋白酶是一种
蛋白水解酶，具有 疏水性的环状结合 部位，能有效的结 合芳环。 • 催化部位有57号组 氨酸咪唑基，102 号天冬氨酸羧基及 195号丝氨酸羟基。
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• 第一个模拟转氨酶模型1980年 被报道，磷酸吡哆胺连在β-CD 上，模拟酶的转氨反应比磷酸 吡哆胺单独存在是快200倍， CD空腔能稳定结合类似亚胺中 间体的过渡态。
• 最大特点：良好的立体选择性， β-CD的手征性，产物氨基酸也 具有光学活性。
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• Han等人合成了含核糖的CD酶模型，兼具 核酸酶、连接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的 活力。
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• 较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠 醚、环番、环芳烃、卟啉等大环化合物；
• 大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印 迹酶模型、胶束酶模型。
• 化学修饰、基因工程改造天然酶产生的半 合成人工酶。
• 抗体酶
理论基础
• 主客体化学：主体和客体通过配位键或其他次级 键形成稳定复合物的化学领域。本质上，来源于 酶和底物的相互作用，主体和客体在结合部位的 空间及电子排列的互补。
• 核糖中相邻的二个羟基是关键，水解环状 磷酸酯的速率提高33倍。
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CD分子研究热点
– CD和底物的结合常数104L/mol,<酶， – 过去的工作：CD的修饰，在CD的两面引入催
化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团， 改善CD的疏水结合和催化功能，通常只有单包 结部位和双重识别作用。 – 现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重 或多重疏水结合作用和多重识别作用，结合常 数108L/mol,
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• 四桥连的CD模拟P450酶（抗氧化酶， 细胞色素），P-450 活性中心的金属卟啉 分子与4个CD相连，