总糖和还原糖的测定

总糖和还原糖的测定

──3,5－二硝基水杨酸法

目的要求：

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

实验原理:

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色

试剂和器材

一、试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

二、材料

藕粉，小麦淀粉或玉米淀粉。

三、器材

723PC、S22型分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

一、葡萄糖标准曲线制作

取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量OD540 /ml /ml /mg

0 1 0

0.2

1

0.8

0.4

2 0.4 0.6 0.8

3 0.6 0.

4 1.2

4 0.8 0.2 1.6

5 1 0 2

操作方法

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

二、样品中还原糖的提取

准确称取0.5g小麦（）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

三、样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g小麦(玉米)淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

四、样品中含糖量的测定

加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。

五、结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；

V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；

m──样品重量，g；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

植物组织中糖和淀粉含量的测定

植物碳水化合物含量的测定，通常是先用80－85﹪乙醇提取，在此浓度的乙醇溶液中，还原糖和非还原糖（主要是蔗糖）溶解而淀粉沉淀，然后过滤，滤液用于测定可溶性糖（包括还原糖和蔗糖），残渣用于测定淀粉。还原糖可根据其还原能力大小直接测定其含量，蔗糖和淀粉先经水解生成还原糖，测其含量，然后换算成蔗糖和淀粉含量。本实验的目的在于掌握植物组织中可溶性糖和淀粉含量的测定原理和方法。

Ⅰ、还原糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸法）

一、目的

掌握用3,5—二硝基水杨酸法测定植物组织中还原糖含量的原理和方法。

二、原理

3,5—二硝基水杨酸与还原糖共热后，被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液颜色深浅成比例关系，用分光光度法可测知样品的含糖量。该方法为半微量定糖法，操作简便，快速，较少受其他杂质干扰。

三、材料、仪器设备及试剂

1.材料：马铃薯；水果类及其他植物。

2.仪器设备：分光光度计；电子分析天平；恒温水浴锅；试管；移液管；试管架；移液管架；研钵（或捣碎机）；洗耳球等。

3.试剂及配制：

3,5—二硝基水杨酸试剂（以下称DNS试剂）配制：

A液—称取6.9g结晶的重蒸馏的酚于15.2ml 10﹪氢氧化钠溶液中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。此液为A液。

B液—称取225g酒石酸钾钠，加入到300ml 10﹪氢氧化钠溶液中，再加入880ml 1﹪ 3.5—二硝基水杨酸溶液，此液为B液。

将A液与B液相混合，即得黄色的DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下放置7—10d 以后使用。

1mg·ml－1葡萄糖标准母液配制：准确称取0.1g分析纯无水葡萄糖溶于蒸馏水中，溶解后定容至100ml。

85﹪乙醇。

四、实验步骤

1. 葡萄糖标准曲线制作

1.1取7支25ml刻度试管，编号，按下表配制每管含量为0～1.2mg的葡萄糖标准液。

加入表中试剂后，摇匀，放入沸水浴中加热5min，立即取出用自来水冷却，然后向每管加入21.5ml蒸馏水，使总体积为25ml,摇匀后，以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值。

1.2标准曲线绘制

以1～6管葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.样品中还原糖的提取

称取发芽马铃薯10g，磨碎（或捣碎），加入85﹪乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min（其间摇动数次），将上清液过滤到100ml容量瓶中，滤渣再用20ml 85﹪乙醇二次提取，一并过滤到容量瓶中，最后用85﹪乙醇定容至刻度，摇匀备用。

3. 样品中还原糖含量的测定

取4 支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入样品糖分提取液1ml及蒸馏水1ml，1支空白管加2ml蒸馏水，然后各管再加入DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长处测定吸光度（A）值。

五、结果计算

根据样品液所测得的吸光度值，从标准曲线查出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中的还原糖百分含量。

提取液总量（ml）

从标准曲线上查得还原糖(mg)×———————————

测定时提取液用量（ml）还原糖（﹪）= ———————————————————————————×100

样品重（mg）