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生物样本的单核苷酸多态性(SNP)位点检测--高通量飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)

生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）1 适用范围本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。

本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭子、唾液等。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）农业部1782号公告-12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的通知(卫办医政发〔2010〕194号)3、术语和定义3.1 rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（reference SNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submitted SNP）。

3.2 单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸-A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。

3.3 等位基因（allele）一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。

若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。

SNP检测方法汇总

TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。

PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。

PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。

当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。

特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。

两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。

根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。

整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。

尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。

RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。

尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。

技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。

它是第一代DNA分子标记技术。

Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。

已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。

RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。

SNP检测

SNP(single nucleotide polymophism) ，即单核苷酸多态，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。

一般来说，一个SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。

SNP研究包括SNP发现（discovery）、SNP验证（validation）以及SNP筛选（Screening or Scoring）。

广泛用于群体遗传学研究（如生物的起源、进化及迁移等方面，将逐渐取代微卫星而成为新一代的分子生物学标记），和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

1.直接测序法在所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP 分析的金标准。

通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。

服务内容（1）样品基因组DNA提取（2）根据不同的区域进行引物设计、合成（3）对所有样品进行基因扩增并纯化（4）测序（5）统计与分析客户提供血液样品：样品为EDTA抗凝或柠檬酸钠抗凝，样品量大于1ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存；组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）、石蜡包埋组织或95%乙醇中固定的组织，组织量大于50µg 细胞、菌液等。

我们提供详细的实验流程；电泳图；测序谱图；SNP基因型统计结果。

2.Taqman探针法（定量PCR）客户根据实验要求挑选出SNPs后，提交给我们进行引物与探针设计与合成，通过进行基因组DNA抽提，并进行定量PCR检测，帮您轻松完成大量样品的检测与分析。

技术特点适合位点数量少，样本通量高的检测；应用定量PCR仪进行定量检测；操作简便，只需一步PCR 反应，无须进行纯化和预处理，直接上机检测；结果清晰，软件分析结果界面友好，标出了每个样本的基因型及荧光强度，非常直观。

服务内容引物及探针的设计及合成；样品DNA抽提；PCR方案的制定；上机检测，数据采集与分析客户提供血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于1ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存；组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）、石蜡包埋组织或95%乙醇中固定的组织，组织量大于50µg 细胞、菌液等。

SNP及检测技术

1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。

但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。

所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。

从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。

SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。

一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。

依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。

因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。

这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。

SNP检测技术

PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。
特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。
基因芯片技术( Genechips)
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,ASPCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条带。
变性高效液相色谱( DHPLC)

SNP及检测技术

1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。

但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。

所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。

从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。

SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。

一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。

因此，通常所说的SNP 都是二等位多态性的。

这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。

SNP检测方法(讲课版)2

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3.以构象为基础的方法

单链构象多态性( single strand conformational polymorphism ,SSCP) 温度梯度凝胶电泳( temperature gradient gel electrophoresis ,TGGE) 变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient ge electrophoresis ,DGGE) 变性高效液相色谱检测 ( denaturing high performance liquid chromatography ，DHPLC)
CCR(combined chain reaction )
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基本步骤
1、DNA模板的变性 2、引物和单链模板间的退火 3、DNA聚合酶(无5′- 3′外切酶活性) 催化引物延伸 4、延伸引物的3′端和下游引物5′端间的连接。
2
优点：
1.快速简单，仅需DNA 的分离、CCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳检测产物几步 2. 产生的产物片段大, 通过琼脂糖凝胶电泳就可实现对产物的检测（不需引物标记等繁琐技术）
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基本原理和步骤
1.质谱分析在样品分子离子化后,根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定分子量，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开。 2.样品来源可以是PCR 产物、引物延伸反应、入侵者酶切产物等,通过质谱可直接检测样品或探针的不同质量,推导出样品的SNPs. 3.利用质谱分析一个样品只需几秒钟, 具有快速、准确、自动化程度高和高通量等特点. 5.主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检测。
3
LRCA (ligation-rolling circle amplication）

SNP检测详细步骤

SNP检测(中文)Part I：样本基因组DNA的提取1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。

冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。

重复洗2次。

2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。

3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。

4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。

5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。

6.用等体积的氯仿再抽提一次。

7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。

8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。

9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。

冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。

10.沉淀于100 μl超纯水中。

11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。

Part II：SNP分型检测1.引物的设计与合成(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成2.PCR扩增片段(1)PCR扩增体系：Components Volume (μl)DNA template1PrimeSTAR0.5dNTPs (2.5 mM)1Primer-F (10 μM)1Primer-R (10 μM)15*PS buffer(Mg2+)10ddH2O1(2)PCR扩增程序：(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。

SNP单核苷酸多态性检测技术

1定义：单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism，SNP），主若是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所惹起的 DNA 序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常有的一种。

占全部已知多态性的 90%以上。

SNP 在人类基因组中宽泛存在，平均每 500～1000 个碱基对中就有1 个，预计其总数可达 300 万个甚至更多。

SNP 所表现的多态性只波及到单个碱基的变异，这类变异可由单个碱基的变换（transition）或颠换（transversion）所惹起，也可由碱基的插入或缺失所致。

但平时所说的 SNP 其实不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（ SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。

所谓变换是指同型碱基之间的变换 ,如嘌呤与嘌呤 ( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的取代 ;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶 (A2T 、A2C 、C2G、G2T) 之间的取代。

从理论上来看每一个 SNP 位点都能够有 4 种不同的变异形式，但实质上发生的只有两种，即变换和颠换，两者之比为 2：1。

SNP 在 CG 序列上出现最为频频，而且多是C 变换为 T ，原因是 CG 中的 C 常为甲基化的，自觉地脱氨后即成为胸腺嘧啶。

一般而言， SNP 是指变异频率大于 1 %的单核苷酸变异。

在人类基因组中大体每 1000 个碱基就有一个 SNP ，人类基因组上的 SNP 总量大体是 3 ×106个。

依照排列组合原理 ,SNP 一共能够有 6 种取代情况,即 A/ G、 A/ T 、A/ C 、C/ G、C/ T 和 G/ T ,但事实上 ,变换的发生频率占多数 ,而且是 C2T 变换为主 ,其原因是 Cp G 的 C 是甲基化的 ,简单自觉脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也所以变为突变热点。

理论上讲，SNP 既可能是二等位多态性，也可能是3 个或4 个等位多态性，但实质上，后两者特别少见，几乎能够忽略。

SNP筛查

SNP筛查SNP筛查采用的是PCR产物直接测序法，而不应该采用PCR片段经克隆后测序的方法。

因为PCR扩增过程终会出现许多错误配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。

PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。

如果在某一点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了，因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模版最原始的结果。

而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列，在几十个循环的PCR 扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在一些错配的序列。

Sequence analysis and editing for bisulphite genomic sequencing projects CATS法(Comparative Anchor Tagged Sequences，CATS)即比较锚定示踪序列，作为不同物种基因组共有的DNA序列，可作为比较基因组定位的锚定参考位点和界标（Lyons，1997）.CATS法选择研究较深入，标记稠密的人和哺乳动物（如小鼠）间在进化上高度保守的功能基因序列设计引物，借助PCR技术搜寻研究欠深入的其他哺乳动物基因组中的基因。

基于目标基因的CATS法主要是根据2个或2个以上的物种中已知的外显子序列设计引物，用于扩增其他物种中非编码的内含子序列。

由于非编码区核苷酸的变异率明显高于编码序列，内含子区段包含的丰富的序列变异被广泛地应用于系统发生和种群遗传学分析（OpBrien et al . , 1993 ; Lyons，1997）目前用于SNP位点检测和搜寻的技术较多（Kwok，2000；Syvanen，2001）Vinter（The sequence of the Human Genome,Science）估计，在所有的SNP中，仅仅只有2000个与氨基酸变异联系在一起。

单核苷酸多态性及其应用详解演示文稿

第21页，共39页。
▪
焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系
中的酶级联反应:
▪
包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;
▪
反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS)和萤
Байду номын сангаас光素。
▪
反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。
第22页，共39页。
▪ 在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 ▪ 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中
第13页，共39页。
5‘
供者
Taqman 探针
3‘ 受者
第14页，共39页。
5‘ 供者
Taqman 探针
3‘ 受者
第15页，共39页。
引物目标序列
供者 5‘
受者 3‘
第16页，共39页。
引物
目标序列
供者
5‘
受者 3‘
第17页，共39页。
SNP的检测方法
分子信标(molecular beacon)法
原理：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥，蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质谱仪的真空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋白质或核酸分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时可通过质谱分析这些离子。
并释放焦磷酸基团(PPi)。
▪
掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATP由
deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代．

SNP及检测技术

1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性.它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。

但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。

所谓转换是指同型碱基之间的转换，如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶（T2C) 间的替换；所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。

从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种,即转换和颠换，二者之比为2:1。

SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ,原因是CG 中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶.一般而言，SNP 是指变异频率大于1 ％的单核苷酸变异。

在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。

依据排列组合原理，SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ，但事实上，转换的发生频率占多数，而且是C2T 转换为主，其原因是Cp G的C 是甲基化的，容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上,后两者非常少见，几乎可以忽略。

因此,通常所说的SNP都是二等位多态性的.这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。

SNP检测方法汇总

现在SNP得常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。

Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但就是价格也非常得高，但就是对于少样本、超多位点还就是非常好得选择。

SNP检测方法汇总分析SNP得方法有许多种，本文收集目前还在用得方法，按通量从高到低排列：全基因组测序这就是最贵得方法，但也就是瞧SNP最全得方法大概一个人样本，花2万元外显子组测序外显子组测序，也可以得到较全面得SNP信息大概一个人样本，花1、5万元随着人全基因组测序得价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场全基因组SNP芯片原理，核酸杂交，荧光扫描Illumina与Affymetrix都有很著名得全基因组SNP芯片，例如：Affymetrix: CytoScan，SNP 6、0，Illumina: 660，中华，450K等SNP芯片，在2000~5000元每样本，还就是比全基因组测序得2万元一个样本得价格要低质谱法原理，精确测量PCR产物得分子量，就可以知道SNP位点上就是A/C/G/T中得哪一个Sequenome MassArray法测中等通量得SNP位点就是十分准确得单个位点、单个样本得费用约2元人民币无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规得PCR引物就可以做实验了如果测几十个点，到上百个点，就是很方便得方法SNPseq法此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点原理：用Goldgate法做出针对某些位点得多重PCR片段高通量测序，数据分析得到SNP位点结果SNPlex中等偏高通量得方法，一次几十个位点原理：用末端特异得引物做多重PCR，把模板进行扩增基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色SNaPshot中等通量得方法设计3'位挨着目标位点得探针用双脱氧得荧光标记ddNTP做一个碱基得延伸毛细管电泳，瞧延伸得这个碱基就是什么颜色Taqman法Taqman原理，如果要找原理，请回复“荧光”两字Taqman方法，一次一管测一个位点通量最低，但就是结果可靠原理：设计与SNP位点互补得荧光探针，其中一个标VIC（红色荧光基团）,另一个标FAM（绿色荧光基团），同时分别有淬来基团吸光Taq酶有5'-->3'得外切酶活性，如果探针粘有模板上，就被切碎探针被切碎后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。

07 单核苷酸多态性(SNP)实验

单核苷酸多态性（SNP）实验SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。

据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。

实验方法原理：SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。

据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。

SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。

一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。

于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。

大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。

一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。

实验材料：组织样品试剂、试剂盒：液氮、PBS、GA缓冲液、GB缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、蛋白液、漂洗液等仪器、耗材：离心管、离心机、废液收集管、吸附柱、水浴锅、分光光度计、低温冰箱等实验步骤：一、DNA抽提1. 取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5 ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。

2. 加200 μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。

加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。

3. 加220 μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。

单核苷酸多态性SNP检测技术34页PPT

单核苷酸多态性SNP检测技术
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在我们的后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚的工人总是说工具不乎能克服任何恐惧。因为，请记住，除了在脑海中，恐惧无处藏身。-- 戴尔．卡耐基。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非

SNP检测方法

SNP检测方法（百度知道）现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。

Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准备，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。

人们对SNP 的研究方法进行了许多探索和改进。

SNP 分析技术按其研究对象主要分为两大类,即:①对未知SNP 进行分析,即找寻未知的SNP 或确定某一未知SNP 与某遗传病的关系。

检测未知SNP 有许多种方法可以使用,如温度梯度凝胶电泳( TGGE) 、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、单链构象多态性(SSCP) 、变性的高效液相色谱检测(DHPLC) 、限制性片段长度多态性(RFL P) 、随机扩增多态性DNA(RAPD) 等,但这些方法只能发现含有SNP 的DNA 链,不能确知突变的位置和碱基类别,要想做到这一点,必须对那些含有SNP 的DNA 链进行测序。

②对已知SNP 进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。

筛查已知SNP 的方法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO) 、突变错配扩增检验(MAMA) 、基因芯片技术(gene chips) 等。

由于人类基因工程的带动,许多物种都已开始了基因组的项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体的序列, 就可以检测到SNP。

目前,可供利用的公开SNP 网上资源主要包括: ①由美国国立卫生研究院( National Institutes of Health ,NIH) 提供的主要是与癌症和肿瘤相关的候选SNP 数据库: http :/ / cgap. nci. nih. gov/ GAI ;②由NIH 开辟的适于生物医学研究的dbSNP 多态性数据库: http :/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ SNP ; ③德国的HGBAS 网站提供的人类SNP 数据库:http :/ / hgbas. Cgr. ki. sei 等。