生物固氮测定方法研究进展

２４ＧｒａｓｓｌａｎｄａｎｄＴｕｒｆ（Ｂｉｍｏｎｔｈｌｙ）２００５Ｎｏ．２（ＳｕｍＮｏ．１０９）

生物固氮测定方法研究进展

陈朝勋１，席琳乔２，姚拓２…，张虎２，张德罡２

（１．云南省曲靖市麒麟区畜牧局，云南曲靖６５５０００；２．甘肃农业大学草业学院，

甘肃兰州７８００７０；３．兰州大学干旱与草地生态教育部重点实验，甘肃兰州７３００００）

摘要：对生物固氮测定的方法乙炔还原法（ＡＲＡ）１５Ｎ同位素稀释法（ＩＤ）１５Ｎ自然丰度法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述，并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。

关键词：生物固氮；固氮量；测定；方法

中图分类号：Ｓ１４４．５文献标识码：Ａ文章编号：１００９～５５００（２００５）０２—００２４—０３

目前，固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。随着研究的深入，固氮测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。生物固氮测定方法主要有乙炔还原法（ＡＲＡ）、１５Ｎ同位素稀释法（ＩＤ）、１５Ｎ自然丰度法、非同位素法、ＡＮ法、全氮差值法和酰脲估测法等。为便于更好研究生物固氮，本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点，以供参考。

１乙炔还原法

始于２０世纪６０年代，目前被广泛应用，根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力，使乙炔还原为乙烯，作为固氮的间接测定。从植物根际分离的纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中，置于２８～３０℃培养箱中培养４８ｈ，将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞，用无菌注射器抽出１０％的气体，每瓶注入１ｍＬＣ２Ｈｚ，再置于２８～３０。Ｃ下培养２４－－４８ｈ。用无菌注射器从瓶种抽取混合气体０．２ｍＬ注入气相色谱仪（ＧＣ）进样柱中，测定Ｃ：Ｈ。含量。其中，以不接种菌注有Ｃ：Ｈ。的血清小瓶为对照，重复３次。从显示屏上Ｃ。Ｈ：、Ｃ。Ｈ。峰值判定有无一一蔫蒜盏豪鬻段藩湍鬻

收稿日期：２００４—０９—２７；修回日期：２００４—１＂ｏ一２８

基金项目：国际原子能机构（ＩＡＥＡ）项目（ＣＰＲ－５—０１４）和甘

肃省科学技术攻关项目（２Ｇｓ０３５一Ａ４１－００ｌ一０４）

中国博士后科学基金（２００４—０３５—１７６）作者简介：陈朝勋（１９５４一），男，云南省曲靖市人，主要从事

畜牧及草地微生物工作。张德罡为通讯作者。ｃ：Ｈ。的产生以确定其固氮性能［１］，按下式计算其固氮酶活性大小心ｊ。

该方法优点是灵敏度高，操作较简单，速度快、费用较低，可快速确认固氮作用的存在与否。并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——固氮菌联合体的固氮量。适应范围广，可以离体，也可以整株活体连续测定或原位测定。

缺点是不能直接而准确的获得生物固氮量，不适于长时期田间共生固氮的定量测定，只能短时间内测定固氮酶活性动态，长时间测定时必须考虑到周围环境的影响。在理论上可以用Ｃ。Ｈ：与Ｈ比为３：１换算固氮结果，实际上已报道的有１．５：１．０～２５：１．０的各种比例。尤其对田间系统更复杂。因此，要在控制条件下测定或在田间单因子条件下测定，以便进行校正。准确性差、结果可靠性不强口］。

２１５Ｎ同位素稀释法

ＩＤ的原理是将固氮系统暴露在“Ｎ中，经一定时间后，如果在该系统中发现了“ＮＨ。或其衍生物，则可判定发生了固氮作用，１５Ｎ示踪法灵敏度高，是固氮研究中确认菌株有无固氮能力最直接最可靠的方法。并且适用于自然田问原位或施人某种固氮菌剂后的作物根际联合固氮量的测定，是确定固氮作用定性和定量的最标准方法。不需校正因子，并可以校正定氮的一些技术操作。该方法被认为是最有效而实用的方法。

固氮植物和非固氮植物（作为参考植物）生长在施用相同量１５Ｎ标记肥料的土壤中，如果两种植物从土壤和肥料中吸收相同比例的Ｎ素，在没有其他Ｎ素来

草原与草坪双月刊２００５年第２期总第１０９期２５

源的情况下，两种植物体内应有相同的１５Ｎ／“Ｎ组成。当豆科植物固氮时，由于利用了空气中没有标记的Ｎ素，植物体内１５Ｎ浓度将被稀释，１５Ｎ／“Ｎ比例下降，而参考植物的比例不会发生变化，从空气中固定的Ｎ素占豆科植物全部Ｎ素的比例（％Ｎｄｆａ）可通过下式计算‘３～６Ｉ：

ＧＮｄｆａ＿（１一篇器）×１００

其中％ＮｄｆＦ为固氮植物体内１５Ｎ的原子百分超；％ＮｄｆＮＦ为非固氮植物体内１５Ｎ原子百分超

总固氮量一％Ｎｄｆａ×固氮植物体内全Ｎ量

ＩＤ的优点是灵敏度高、准确度高可靠性强可以校正非直接测定法的准确性、也能够测定田间综合条件下的固氮量，而且能够区分来源于空气、土壤、肥料中的Ｎ素量，在选育高固Ｎ能力的品种试验中只需要比较固Ｎ植物体内１５Ｎ的含量不需要参考植物的数据。能够确定某种细菌是否固氮，适合联合固氮菌固氮量的测定。不需选择参考植物。

缺点是需要选择参考植物，它会影响固Ｎ量的精确性，不会造成很大的测定偏差。选取同一土壤库中吸收养分相似的根系类型，有相似的Ｎ素吸收类型和生长速率。１５Ｎ价格昂贵，测定手段繁琐，易受大气和土壤中１５Ｎ的干扰。

３非同位素法

通常，磷的含量是随着氮水平的增加而增加，在植物成熟期积累更多的磷。接种微生物肥料磷的吸收显著增加。这种方法是应用了全量、１／２量、１／４量和不施肥，其中以不接种为对照。在植物成熟后，收集样本风干测定总产量，进行化学成分分析（全氮和全磷的含量），ＡＲＦ计算公式如下［９ｊ：

ＡＲＦ％一訾Ｘ１００

其中ＡＲＦ：固氮百分数；ＮＰ：接种土壤植物吸收的全氮；ＮＰ。：非接种土壤植物吸收的全氮；ＮＦ：施氮水平。

非同位素的优点是简单、易行、不需要较精密的仪器、成本低；缺点是时间较长，需要测定全产，不能估计因减产而造成的试验误差，因氮肥的施用量不同，会影响测定结果。高氮施肥水平导致作物从根、作物吸收的氮减少［９］。

４全氮量差法

全氮增加是固氮量测定可用全氮增加来衡量，在无化态氮来源情况下，若生命系统中全氮量有净增加则表明有固氮作用发生。全氮分析有两种基本方法，凯尔道氏湿消化法和杜马氏干烧氧化法，比较固氮系统和不固氮系统中全氮量，以确定固氮量。固氮量计算为固氮系统全氮减去非固氮体系全氮。

总氮差值法一固氮作物总氮一对照作物的总氮［１０，ｎ３。

５酰脲估测法

在开花初期和结荚初期，采鲜样测定幼茎段（包括叶柄）烘干磨碎后测定酰脲含量全氮含量（凯氏定氮法），硝态氮含量氨态氮含量（茚三酮法）；最后计算酰脲相对丰度：酰脲一Ｎ／（酰脲Ｎ＋硝态～Ｎ＋氨态一Ｎ）×１００％。固氮酶活性与幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度均呈极显著正相关。酰脲是氮素固定的代谢产物，因此，可以估测固氮量［１引。

６自然丰度

现在已经知道，同位素的自然丰度变异是自然界普遍存在的生物化学一地球化学现象，其变异是由在自然界特别是在生物体中进行一系列生物、化学、物理过程中产生的同位素分馏效应所引起的。由于氮元素的同位素在参与生物、化学和物理过程中产生同位素歧视效应，即轻同位素优先参与反应过程，使反应生成物相对富集轻同位素（１４Ｎ），反应的起始物相对富集重同位素（１５Ｎ），这一同位素分馏效应，将使计算结果偏高，为此，必须进行以空气为唯一氮源的砂培试验。各种自然含氮物质的稳定性同位素１５Ｎ相对于大气Ｎ。的１５Ｎ的变化数值以艿１５Ｎ表示［１∽１４］：

泸Ｎ‰一堕辈靛铲灿ｏｏ

式中：Ｒ代表ｍ／ｅ２９（１５Ｎ１４Ｎ）的离子流强度和ｍ／ｅ２８（“Ｎ“Ｎ）的离子流强度的比值，标准样品为大气Ｎ。，样品的Ｒ值可大于或小于标准的Ｒ值，大于标准样品时，测得艿１５Ｎ值为正值，表示样品的１５Ｎ丰度高于标准物质；小于标准样品时，艿１５Ｎ为负值，表示样品的１５Ｎ丰度低于标准物质。

在应用１５Ｎ自然丰度法计算固氮植物固氮量时，有关参数的选择至关重要。应用１５Ｎ自然丰度（ｄ１５Ｎ）法计算固氮植物的固氮百分率（％Ｎｄｆａ）用下列公式计算‘１“：