噬菌体的分离

大肠杆菌噬菌体分离 枯草芽孢杆菌噬菌体分离
大肠杆菌斜面 4mL无菌水
枯草芽孢杆菌斜面 4mL无菌水
大肠杆菌菌悬液
枯草芽孢杆菌菌悬液
2.增殖噬菌体 增殖噬菌体 污水200mL 大肠杆菌菌悬液2mL 感染噬菌体发酵液200mL 枯草芽孢杆菌菌悬液2mL
3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL
增值混合液
微生物学实验
实验十 噬菌体的分离
一、实验目的 二、实验原理 三、技术路线 四、实验器材 五、实验内容 六、方法步骤 七、作业
二、实验原理
•噬菌体在活细胞内才能增殖； •噬菌体与宿主细菌有寄生特异性； •1个噬菌体与1个宿主细菌可构成1个感染单位（中心）， 形成1个噬菌斑。
噬菌体 细菌 培养基
采集样品 增殖噬菌体
按前面方法制备噬菌体裂解液
6.计数（效价测定） 计数（效价测定） 计数 在平板中倒入50℃下层培养基10-15mL,冷凝 用0.9mL无菌肉汤将噬菌体裂解液做10倍系列稀释 在4mL 48℃上层培养基中加入0.1mL噬菌体稀释液和菌液 0.9mL，用双手前后搓动 使混匀，立即倒入下层平板上 将平板倒置于37℃培养12-16h,统计噬菌斑数目
37℃，24h
3.制备噬菌体裂解液 制备噬菌体裂解液
方法1：离心法： 离心3000转/分，15min. 氯仿（0.5mL/10mL上清液） 振荡5min 离心3000转/分，15min.
增值混合液
方法2：过滤法：P142
离Βιβλιοθήκη Baidu4000转/分，15min.
上清液
离心4000转/分，15min.
0.22µm无菌过滤器过滤
氯仿（0.1mL/10mL上清液）
上清液 噬菌体裂解液
不能加氯仿
4.无菌试验和确证试验 无菌试验和确证试验
滤液0.1mL 滤液1滴
枯 大 肠 杆 菌 平 芽 孢 杆 菌 平 板 草
37
12~24h
无菌试验
蚕食状噬菌斑
5.纯化和增值 纯化和增值 在平板中倒入50℃下层培养基10-15mL,冷凝 用4.5mL无菌肉汤将噬菌体裂解液做10倍系列稀释 在4mL 48℃上层培养基中加入0.5mL菌液和0.1mL噬菌体稀 释液，用双手前后搓动 使混匀，立即倒入下层平板上 将平板倒置于37℃培养16-24h,观察噬菌体斑 挑单个噬菌斑接于肉汤培养基，同时接入宿主细菌悬液 1mL,37℃培养24h；取增值液0.5mL转接入10mL液体培养 基，同时接入宿主细菌悬液0.5mL,37℃培养24h
三、技术路线
配制3倍料培养基、 配制 倍料培养基、制备菌悬液 倍料培养基 无菌试验
制备噬菌体裂解液 检验噬菌体 纯化 增值
双层平板法
制备噬菌体裂解液 计数 保藏
五、实验内容
大肠杆菌噬菌体的分离、纯化和计数 枯草芽孢杆菌噬菌体的分离、纯化和计数
任选一种，每4-5人为一个实验小组，2周时间完成
六、方法步骤 1.制备菌悬液 制备菌悬液
计算噬菌体效价 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数×10 噬菌体效价 数 稀释倍数×
报告要求 1、P143：1.结果 2、 P143：思考题（2）、（3）、（4）、 （5）、（6） 3. P145：1.结果 4.P145：2.思考题 （1）、（2）（3）、（4）
步 祝 你 进