流式细胞术染色步骤

流式细胞术染色步骤

在染色之前，首先用1份固定破膜浓缩液放在3份固定破膜稀释液中稀释成想要的工作液的体积，这种缓冲液储存不能超过1天。例如，检测12个样本，用3ml固定破膜浓缩液加入到9ml固定破膜稀释液中。试剂盒中所提供的破膜缓冲液是10倍浓度的，在使用前应该用蒸馏水稀释成1倍的溶液，这种破膜缓冲液应在每次使用前配成新鲜的。

1,加100µl准备好的细胞（1×106）到每一个试管里；

2，通常先标记表面分子，使用大约0.125µg FITC -CD4和0.06µg PE - CD25 抗体放在100µl 流式着色缓冲液中。如果在特殊应用的时候最好滴定这些试剂。4℃避光孵化30min。Fc block可以在表面抗体孵化前加入；

3，使用冷流式细胞着色缓冲液清洗，离心并弃去清洗液1500rmp离心，5分钟4，悬浮细胞沉淀物，给每个样本加1ml准备好的新鲜固定/破膜工作液，再次悬浮溶液；

5，在暗处4℃孵化30min~18h（当用固定/破膜工作液孵化30min~18h不同的时间变化，只要用相同的供者样本，所得到的结果是具有可比性的）

6，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；2500rmp离心，5分钟7，重复步骤6；

8，0.5µg Fc block放在1倍破膜缓冲液，体积调整至100µl ，4℃放置15min；9，阻滞步骤后不用清洗，加0.5µg小鼠PE-Cy5-FOXP3（FJK-16S）抗体或者PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体放入到1倍透化缓冲液中，暗处4℃至少孵化30min。要想在实验中得到最理想的染色请做进一步的滴定；

10，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；3500rmp离心，5分钟11，重复步骤10；

12，悬浮适当的流式细胞着色缓冲液体积，上流式细胞仪检测并且记录，由于固定和破膜的过程中细胞数量的FSC/SSC分布与肝细胞不同，因此需要在入口和电压上做出相应调整。

试剂盒内所含有的试剂：

FITC -CD4 0.1ml （100µl）含50µg 浓度0.5µg /µl 0.125µg=0.25µl

稀释方法：2µl FITC -CD4+18µl PBS 浓度0.05µg /µl 0.125µg=2.5µl

PE - CD25 0.25ml （250µl）含50µg 浓度0.2µg /µl 0.06µg=0.3µl

稀释方法：3µl PE - CD25+27µl PBS 浓度0.02µg /µl 0.06µg=3µl

Fc block：0.1ml （100µl）含50µg 浓度0.5µg /µl 0.5µg=1µl

PE-Cy5-FOXP3（FJK-16S）0.125ml （125µl）含25µg 0.5µg=2.5µl

PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体0.125ml （125µl）含25µg 0.5µg=2.5µl