免疫共沉淀研究生实验课
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• Universal Verification of Interaction Techniques Co-Immunoprecipitation Confocal Microscopy
• Biophysical Verification of Interaction Techniques Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM) Mass Spectroscopy (MS) Atomic Force Microscopy (AFM) Surface Plasmon R免e疫s共o沉n淀an研c究e生(实S验P课R)
免疫共沉淀研究生实验课
抗体的选择：
1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗 体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能结合 未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗 的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉 淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有 助于避免污染的发生；
加入35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ； 1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，加入40μl 2×SDS
Sample Buffer（125mM Tris•Cl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸 5min； Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。
实验目的
• 学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法， 了解免疫共沉淀结果分析。
• 了解与免疫共沉淀相关的实验及进展
免疫共沉淀研究生实验课
概念及用途
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为
基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是
确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的
有效方法。
金标准
用途：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也 可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀研究生实验课
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min ； 吸取上清液到新EP管中，每管加1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
A agarose，4℃转鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min； preclear及其作用 一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或 相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和 protein A－agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的 非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A－agarose非特异结 合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。 琼脂糖珠的选择 SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
免疫共沉淀研究生实验课
实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许 多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白 质 x 的抗体免疫沉淀 x，那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也 能沉淀下来。
YY
binding
wash
elution
免疫共沉淀研究生实验课
免疫共沉淀研究生实验课
免疫共沉淀研究生实验课
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相 互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种 细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变 性剂（0.2％SDS)。 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶 抑制剂，低温下进行实验。 Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在 做磷酸化的信号转导时需添加。
免疫共沉淀研究生实验课
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ lHale Waihona Puke Baidu4℃ 转鼓过夜(10min)；
孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗 原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶 解抗原，过多则抗原被稀释。
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation）
免疫共沉淀研究生实验课
背景
• 据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细 胞可以产生 10,000 种。
• 在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在 于一个蛋白复合体中。
• 蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地 称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。
实验步骤
人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约 90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次；
加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM βGlycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解细胞；
蛋白的相互作用
免疫共沉淀研究生实验课
• Standard Techniques Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins Affinity Tags Tandem Affinity Purification (TAP) Tags Strep-Tag III Quantitative Proteomics Chemical Crosslinking Two-hybrid Yeast Phage-display
2.使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
3. 抗体用量的控制：1-4μg（通常用2 μg ）
• Biophysical Verification of Interaction Techniques Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM) Mass Spectroscopy (MS) Atomic Force Microscopy (AFM) Surface Plasmon R免e疫s共o沉n淀an研c究e生(实S验P课R)
免疫共沉淀研究生实验课
抗体的选择：
1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗 体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能结合 未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗 的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉 淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有 助于避免污染的发生；
加入35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ； 1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，加入40μl 2×SDS
Sample Buffer（125mM Tris•Cl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸 5min； Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。
实验目的
• 学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法， 了解免疫共沉淀结果分析。
• 了解与免疫共沉淀相关的实验及进展
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概念及用途
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为
基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是
确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的
有效方法。
金标准
用途：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也 可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀研究生实验课
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min ； 吸取上清液到新EP管中，每管加1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
A agarose，4℃转鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min； preclear及其作用 一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或 相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和 protein A－agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的 非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A－agarose非特异结 合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。 琼脂糖珠的选择 SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
免疫共沉淀研究生实验课
实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许 多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白 质 x 的抗体免疫沉淀 x，那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也 能沉淀下来。
YY
binding
wash
elution
免疫共沉淀研究生实验课
免疫共沉淀研究生实验课
免疫共沉淀研究生实验课
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相 互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种 细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变 性剂（0.2％SDS)。 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶 抑制剂，低温下进行实验。 Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在 做磷酸化的信号转导时需添加。
免疫共沉淀研究生实验课
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ lHale Waihona Puke Baidu4℃ 转鼓过夜(10min)；
孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗 原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶 解抗原，过多则抗原被稀释。
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation）
免疫共沉淀研究生实验课
背景
• 据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细 胞可以产生 10,000 种。
• 在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在 于一个蛋白复合体中。
• 蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地 称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。
实验步骤
人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约 90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次；
加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM βGlycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解细胞；
蛋白的相互作用
免疫共沉淀研究生实验课
• Standard Techniques Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins Affinity Tags Tandem Affinity Purification (TAP) Tags Strep-Tag III Quantitative Proteomics Chemical Crosslinking Two-hybrid Yeast Phage-display
2.使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
3. 抗体用量的控制：1-4μg（通常用2 μg ）