水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展

水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展摘要:啤酒酵母葡聚糖是一类免疫多糖,参与生物细胞的多种生命调节,可激活免疫细胞,调节机体免疫力,具抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤等功能,且毒副作用低,被称为生物效应应答剂。

近年来,越来越多的学者开始研究和开发酵母葡聚糖。

论文对酵母葡聚糖的结构、提取方法、结构修饰和应用进行了简述,对提取方法和结构修饰中的各种方法进行了综合比较和分析;并重点介绍了提高酵母葡聚糖的水溶性的方法及相对应的鉴定方法,这将为酵母葡聚糖的开发利用奠定一定的理论基础。

除此之外,论文还对酵母葡聚糖的进一步开发利用进行了展望。

关键字:酵母葡聚糖;提取方法;分子修饰;鉴定啤酒酵母葡聚糖是从啤酒酵母细胞壁中提取的一种葡萄糖聚合物,因为它具有增强免疫功能的能力,被誉为是生物效应应答剂[1]。

研究表明,啤酒酵母葡聚糖对哺乳动物的特异性和非特异性免疫功能均有刺激作用[2],可以促进巨噬细胞对多种病原,如细菌、病毒、真菌和寄生虫等的免疫反应,进而提高机体免疫系统对病原体侵入的抵抗力。

但由于酵母葡聚糖难溶于水和纯度低等原因,限制了它作为药物在生产中的应用,因此开发和利用水溶性酵母葡聚糖,具有广阔的应用前景和市场开发潜力。

1 酵母细胞壁的结构啤酒酵母细胞壁占细胞干重的20%~30%,酵母细胞壁由29%~64%的B葡聚糖、31%的甘露聚糖、13%的蛋白质、9%的脂类和1%~2%几丁质组成[3]。

葡聚糖是酵母细细胞壁最重要的结构成分之一,其主要包括碱溶性和碱不溶性两种,其中以碱不溶性B-1,3-葡聚糖占绝大多数。

酵母碱不溶性B1,3-葡聚糖是一种活性多糖,制备酵母B-葡聚糖即提取碱不溶性B-1,3-葡聚糖。

目前,其结构研究得较为清楚,大部分是由D-葡萄糖通过B-1,3-键的方式相结合的聚合物,也有小部分以高度分支的B-1,6-键结合的葡聚糖[4]。

B-1,3-葡聚糖生物活性主要由连接方式、分子大小和构象所决定,高分子的B-1,3-葡聚糖具有独特的分子结构,它通常以三股螺旋的构象存在,这种三股螺旋结构对其免疫调节活性起至关重要的作用。

酵母细胞壁中碱不溶性多糖80%以上是B-1,3-D-葡聚糖,其分子质量大约为240 ku,具有很强的免疫活性[5]。

2 酵母葡聚糖的提取目前国内外提取酵母B-1,3-D-葡聚糖的方法主要有酸法、碱法和酸碱综合法等。

2.1 酸法提取酸法提取是最早采用的酵母B-1,3-葡聚糖提取方法。

一般用不同浓度的醋酸在50e~90e温度条件下处理3 h~6 h,离心后沉淀脱水,干燥即得成品。

早期国内外学者对此法进行了较多的研究,黄丹等[6]、黄刚良[7]对此提取方法进行了研究,结果表明,此法虽然产品得率高,但纯度低,产品中蛋白质和甘露聚糖含量高,需要进一步纯化。

由于这些原因使其应用受到一定程度的限制,近年来国外对此提取方法的报道很少。

但若对成品B-1,3-葡聚糖的纯度要求不高,如作为饲料添加剂使用,其不失为一种经济有效的提取方法[8]。

2.2 碱法提取李卫旗等[9]用碱法提取酵母B-1,3-葡聚糖。

用不同浓度的NaOH高温处理3 h~6 h,离心后沉淀脱水,干燥即得成品。

廖鲜艳等[10]对此法进行了改进,采用二步碱处理方法进行提取,降低了碱处理时NaOH溶液浓度,并提高了产品的纯度。

万婕等[11]进一步改进提取工艺,在碱处理后离心,沉淀用蒸馏水悬浮,再用盐酸调节pH至4.5,离心、水洗、脱水、干燥。

由于采用了酸性溶液洗涤,除去了部分酸溶性的糖元及B-1,6-D-葡聚糖,因而纯度又有所提高。

碱法提取所得的产品得率稍低,纯度较高,但产品中还含有少量酸溶性糖元及B-1,6-D-葡聚糖。

此法较适于对提取物纯度要求较高的产品,如食品和医药用品。

2.3 酶-碱法Freimund S等[12]采用碱性Savinase蛋白酶来处理酵母细胞壁制备酵母葡聚糖,得到含量85%以上的葡聚糖样品。

马森等[13]利用木瓜蛋白酶-碱法,得到了纯度为90.50%,得率为11%的酵母葡聚糖。

酶处理酵母细胞壁后能去除大量蛋白,从而降低后续碱的浓度和使用量,使得到的酵母葡聚糖产品分子结构更加完整。

由于葡聚糖的分子结构与其生物活性密切相关,因此,酶法更适合于大规模酵母葡聚糖的提取纯化。

2.4 其他方法除上述传统的方法外,一些研究学者还采用其他方法来制备纯度较高的酵母葡聚糖产品。

日本Ohno N等[14]采用次氯酸钠溶液在室温条件下处理酵母细胞壁得到的高纯度酵母葡聚糖产品,收率为20%。

此方法虽能得到纯度较高的酵母葡聚糖,但是强氧化剂对葡聚糖分子结构的影响还有待深入研究,需考察对其生理活性的影响。

以上方法获得的B-1,3-葡聚糖呈中性,不带电荷,由于其分子内多羟基的相互作用,形成了致密的三股螺旋结构,导致B-1,3-葡聚糖不溶于水,只能作为饲料添加剂通过口服途径来加以利用。

当动物采食含有酵母葡聚糖的饲料后,其特异性和非特异性免疫功能都得到了增强。

但口服途径中会造成一定的浪费,酵母葡聚糖中的有效成分也会在动物体内被消化系统消化掉一部分。

许第新等[15]将从酵母细胞壁中获得酵母葡聚糖以腹腔注射方法,用于增强克氏原螯虾的免疫功能,取得了良好的效果。

但该方法在安全性方面令人担忧。

当腹腔内注射酵母葡聚糖时,不溶或可溶性很差的B-葡聚糖直接注射进动物体内后,可能导致排斥反应,如发炎、疼痛、微栓塞、形成肉芽肿等限制了它作为药物的应用。

如果能提高酵母葡聚糖的纯度和水溶性,通过注射等手段应用于人和动物,来提高其免疫力,对实际应用更有意义。

因此,研究开发水溶性酵母葡聚糖,具有很好的应用前景和市场开发潜力。

3 酵母葡聚糖的结构修饰及鉴定方法酵母葡聚糖的结构修饰是提高葡聚糖水溶性的一种方法。

目前提高葡聚糖水溶性的主要有方法有:物理修饰法,生物修饰法和化学修饰法。

3.1 物理修饰法)))超声波法物理修饰法主要是在不破坏酵母细胞壁多糖基本分子结构的基础上,应用外力方式将其主链打断,使其变为可溶性的小分子,以增加其溶解性。

目前主要使用超声波解聚的方法对酵母葡聚糖进行修饰改性[16]。

张开诚[17]对酸碱法、酶-酸碱法、超声法进行了对比提取试验,结果表明,超声波法提取葡聚糖工艺简便,成本低廉,收率较高,提取后的废液不含酸碱,对环境的污染较酸碱法要小,是一种非常有前途的提取葡聚糖的有效方法。

3.2 生物修饰法)))酶法酶法水解酵母葡聚糖是通过B-1,3-葡聚糖内切酶来降低其聚合度,从而得到水溶性葡聚糖。

B-1,3-葡聚糖内切酶能将B-1,3-葡聚糖水解为低聚糖、寡糖或还原糖。

采用B-1,3-葡聚糖酶法增溶,不仅可通过控制水解度获得一定分子质量的水溶性的B-1,3-葡聚糖,而且可避免使用化学方法带来的污染及安全等问题,因此日益受到重视。

Kery V等[18]研究表明,酶法得率较低。

段会轲等[19]利用木霉菌株所产的B-1,3-葡聚糖酶对酵母B-1,3-葡聚糖进行酶解增溶,得率达到52%。

尽管酶的专一性和活性会对分子质量产生很大影响,其仍具有较好的应用前景。

3.3 化学修饰法酵母葡聚糖的化学修饰已大有进展,利用化学方法对糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团进行衍生化,如硫酸化、羧甲基化、磷酸化和乙酰化等来提高多糖的水溶性和活性。

目前研究比较深入的有硫酸化和羧甲基化。

3.3.1 硫酸化改性酵母葡聚糖硫酸酯是酵母葡聚糖糖大分子链中单糖分子上的羟基被硫酸根取代而形成的一类天然、半合成酸性多糖。

Williams DL等[20]利用均相磺化反应体系制备水溶性葡聚糖。

由于是均相反应体系,产物和底物不好分离、产物杂质高。

黄国宏[21]将葡聚糖分散在二甲基甲酰胺中,以氯磺酸为酯化剂制备出取代度高达0.88的酵母葡聚糖硫酸酯。

这种方法的取代度较高,但氯磺酸等为危险试剂,不易操作。

Wang Y J等[22]采用非均相反应体系制备水溶性的B-1,3-葡聚糖硫酸酯。

非均相反应体系很好地克服了均相体系的缺陷,提高了产物纯度,产物分离容易,且硫酸正丙醇反应液可重复使用,减轻了环境污染。

3.3.2 羧甲基化目前常用的羧甲基化方法是将129王成龙等:水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展葡聚糖溶于NaOH溶液中碱化,再加异丙醇、氯乙酸,获得羧甲基化衍生物。

Sandula J等[23]采用氯乙酸作为底物,与葡聚糖在丙醇中反应,得到了不同取代度的羧甲基葡聚糖。

杨文鸽等[24]以ClCH2-COOH为羧甲基化试剂,获得了取代度为0.925的水溶性葡聚糖。

王庆华等[25]以异丙醇为分散剂、氯乙酸钠为醚化剂,采用二次加碱醚化反应,制备了取代度为0.55羧甲基葡聚糖。

羧甲基葡聚糖的浓溶液属假塑性流体,其流变性质受电解质、温度和pH的影响,升高温度或加入电解质均使其黏度下降,中性pH的羧甲基葡聚糖的溶液的黏度最大[26]。

3.4 酵母葡聚糖衍生物的鉴定方法酵母葡聚糖结构复杂,经修饰后更加复杂,仅用传统的化学方法完全解析多糖结构是十分困难的,在修饰多糖结构解析中常用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振波谱等方法分析多糖取代基的取代情况。

3.4.1 紫外光谱法主要根据扫描的紫外光谱在206 nm处有无吸收峰来判断是否含有酵母葡聚糖。

酵母葡聚糖硫酸酯的紫外扫描图在218、264、268、286nm处有S=O和-SO3的吸收,有别于一般的中性多糖,可用来鉴定葡聚糖硫酸酯[27]。

但是,仅靠紫外光谱还不能完全确定,必须结合其他方法来联合验证。

3.4.2 红外光谱法多糖结构解析中主要采用中红外光谱。

应用此法可以用来鉴定分子修饰的酵母葡聚糖糖。

硫酸酯化葡聚糖链上主要取代基的特征谱为分子间、内氢键使糖羟基在3 600 cm-1~3 200 cm-1处出现一宽峰。

根据红外光谱图是否具有800 cm-1~860 cm-1处糖环C-O-S伸缩振动的特征吸收峰以及1240 cm-1附近-O-SO3的S=O伸缩振动吸收峰,即可定性判断酵母葡聚糖残基是否连接上了硫酸基团及硫酸基团的取代位置(800 cm-1~950 cm-1)。

羧甲基葡聚糖如在波数1 600 cm-1处出现较强的-COO-离子特征吸收峰, 1 423 cm-1出现与羧基相连的次甲基吸收峰,即表明其为羧甲基葡聚糖[24]。

4 酵母葡聚糖的应用4.1 酵母葡聚糖在水产动物方面的应用酵母葡聚糖可加快鱼、虾等水产动物的免疫器官发育,增加淋巴细胞数量,增强体液免疫,对水产动物具有较好的防病、治病作用。

Robertsen B等[28]试验表明,酵母菌聚糖能增强大西洋鲑对灭鲑气单胞菌、鳗弧菌和鲁克耶尔森菌抗感染能力。

研究表明,酵母葡聚糖可提高鲫鱼血清总蛋白的含量, 并且其血清凝集抗体效价、溶菌酶的活性、白细胞的吞噬指数均显著高于空白对照组[29]。

4.2 酵母葡聚糖在家禽方面的应用酵母葡聚糖主要通过激发炎症反应和免疫应答,维持动物胃肠道微生态平衡等来增强动物免疫力,改善动物健康状况,增加其抗应激能力,从而提高生产性能,增加经济效益。