种子的扩大培养
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。
6 种子的扩大培养【发酵工程】
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
种子的扩大培养名词解释
种子的扩大培养名词解释
农业和科学是紧密联系在一起的，从古至今，改良农作物也一直是提高作物品质和效率的重要方式之一。
改良农作物一般涉及品种改良、育种和种子改良等，其中种子改良是改良农作物的重要方式之一，其中包括种子的扩大培养。
扩大培养，是指将植物原色质组织发育至比原色质组织更大的程度，而发育度由细胞膜和细胞壁及细胞固有的特性决定。
扩大培养的目的是为了将植物的细胞增大，形成更大的种子以提高其生物产量和生物效率。
扩大培养的基本原理是营养物质通过细胞膜被吸收，吸收的营养物质再经过细胞板进行变化，以满足细胞的营养和活动需求。
细胞生长过程中，细胞膜和细胞壁发生变化，使细胞产生更多的蛋白质，细胞分裂更多次，以达到膨大的目的。
扩大培养具有很多优势，它可以有效地提高植物的生长速度，从而改善作物质量；它可以增加植物的适应能力，降低对环境的敏感性；它还可以降低由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的抗逆性。
扩大培养的实践也要依据植物的特性而定，比如植物体内的营养物质储备差别，植物体内的养分分配，植物发育程度等。
通常在实验中，需要对外部环境因素进行控制，如光照、温度和湿度，确保植物生长条件良好，才能获得理想的种子扩大培养结果。
总之，种子的扩大培养作为改良农作物的重要方式，可以有效地改善作物质量，增加由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的
抗逆性。
但是，为了获得理想的种子扩大培养结果，需要对外部环境因素进行控制，以确保植物生长条件良好。
种子扩大培养 认识种子扩大培养
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤种子扩大培养是一种常用的细胞培养技术，用于从少量的起始细胞种子扩大培养大量的细胞。
一般情况下，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基，根据所培养细胞的特性和需求，选择适合的培养基。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640等，可以根据需要添加适当的补充物如血清、生长因子等。
2. 准备种子细胞，从原始培养物中取出一定数量的细胞作为起始种子。
细胞可以通过离心、洗涤等方法获得。
3. 细胞计数和调整，使用细胞计数仪对种子细胞进行计数，以确定种子细胞的浓度。
根据需要，可以通过离心和重新悬浮的方式调整种子细胞的浓度。
4. 接种种子细胞，将调整后的种子细胞悬浮液加入到培养皿或培养瓶中。
种子细胞的密度应根据所需的扩大倍数和培养容器的大小进行合理调整。
5. 细胞培养条件的控制，将接种的培养皿或培养瓶放入细胞培养箱中，控制培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
6. 细胞生长监测，定期观察和记录细胞的生长情况，包括细胞形态的变化、细胞数量的增加等。
可以使用显微镜观察细胞形态，也可以通过细胞计数仪等设备对细胞数量进行监测。
7. 细胞传代，当种子细胞达到一定的生长程度时，可以进行细胞传代，即将细胞分离并重新接种到新的培养皿或培养瓶中。
传代的目的是避免细胞过度密集和资源耗竭，以保证细胞的健康生长。
8. 细胞收获，根据需要，可以在细胞达到预期生长程度后，将细胞收获下来进行后续的实验或应用。
收获细胞时，可以使用适当的方法如离心、洗涤等将细胞从培养皿或培养瓶中分离出来。
以上是种子扩大培养的一般步骤。
具体的操作细节可能会因细胞类型、培养条件和实验目的的不同而有所差异。
在进行种子扩大培养时，需要严格控制培养条件，遵循无菌操作规范，以确保细胞的健康生长和培养的成功。
发酵工程第一章 种子扩大培养
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
种子的扩大培养
种子异常分析
1、菌种生长速度过慢 2、菌丝结团 3、菌丝粘壁
第三节
种子制备过程的技术概要
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁
殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 可以用液体培养法。
搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3
搅拌转速300r／ min
500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级 到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养
(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基 200mI，灭菌后置于冲程7．6cm、频率96次 ／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温 度33~34℃ (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
水质的影响：地区不同、季节变化 和水源污染，均可造成水质波动， 影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不 同代谢类型的菌落，氮源品种越多， 出现的菌落类型也越多，不利于生 产的稳定。
措施
培养基所用原料要经过发酵试验合格才可
种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是指通过培养一定数量的种子，生产大量的细胞或微生物的过程。
它是微生物或细胞生产工艺中的重要步骤，能够保证生产规模的扩大和产品的稳
定性。
种子扩大培养的一般步骤如下。
第一步是种子的制备。
在种子扩大培养之前，需要从已有的种子中选取优良的种子，将其经过预处理后进行制备。
预处理的方法可以包括冷冻保存、干燥保存等。
制备好的种子需要进行质量检测，以确保种子的质量符合要求。
第二步是种子的扩增。
在种子扩大培养过程中，需要将制备好的种子接种到适当的培养基中，并进行适当的处理，以促进种子的生长和繁殖。
常见的处理方法
包括控制培养基的pH值、添加适量的营养物质等。
扩增过程需要进行一定时间的
培养，以便种子充分生长繁殖。
第三步是种子的收获。
种子扩大培养完成后，需要进行收获。
在收获的过程中，需要进行分离、过滤、浓缩等操作，以获取目标产物。
此外，还需要对产物进行纯化和检测，以确保产物的质量符合要求。
总之，种子扩大培养是微生物和细胞生产工艺中不可或缺的步骤，对于产品的质量和产量都有着重要的影响。
在实际应用中，需要根据具体情况进行调整，以
确保最终的产物能够满足要求。
种子的扩大培养
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
二、注意事项
（1）按照无菌操作
（2）消毒灭菌一定要彻底、干净
（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生 产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。
实验室种子扩大培养一般流程
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6.种子的扩大培养
生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
第二章种子扩大培养ppt课件
可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养 后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子；
把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子；
将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因 不同菌种而异，但其原则为采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐 等，如果是需氧菌，同时还需供给足够 的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
定义：菌种的扩大培养就是把保藏 的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中 处于休眠状态的生产菌种接入试管 斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种 子罐，逐级扩大培养后达到一定的 数量和质量的纯种培养过程。这些 纯种的培养物称为种子。
种子罐培养 e.g. yeast： 原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
（25 °C ~27°C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐 （15 °C ~20 °C ，3~5天）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
【精选】第五章种子扩大培养
二、生产车间种子制备
以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做 种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对 种子的要求。
种子罐培养原则：
采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐 等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
摇瓶菌丝体种子： 可在火焰保护下接入种子罐或 采用压差法接入。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时 间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶
液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。
（3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中， 就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会。
（4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根 据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子 扩大培养的级数。
种子液(几或几十立方米)
按10%接种量
发酵罐(几十或几百立方米)
由实验室制备到车间生产 的过程
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
种子的扩大培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
第二章 种子扩大培养
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
第五章种子的扩大培养
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 12 / 20 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机 m3 盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 154 / 240 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐 m3 等
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体 的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1. 斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天，注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2. 大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素 为7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发 酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列 腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作 用。发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
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◇ 一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产 品为培养基。
◇ 培养的温度：一般为25～28˚C。 ◇ 培养时间：4～14天。
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③ 放线菌孢子的制备
◆ 一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适 合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约为 1%，氮源不超过0.5%） 。
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对于不产孢子的赤霉素生产菌 （Gibberelline fujikuroi），也可用大米 固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种 子罐种子。
不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆 菌（Corynebacterium）、短杆菌 （Brevibacterium），生产上一般采用斜 面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养， 获得细胞悬液再接种。
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对于不产孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是 获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。
三角瓶摇床培养
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对于产孢子的微生物
➢ 获得一定数量和质量的孢子：
对于产孢子能力 强及孢子发芽、生长迅速的菌种可 采用固体培养基培养孢子，所获孢子可直接作为种子罐 的种子。
菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
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第二节 种子制备技术概要
一、种子制备的过程
1－砂土孢子 2—冷冻干燥孢子 3－斜面孢子 4—摇瓶液体培养 5—茄子瓶斜面培养 6—202固0年7体月4日培星期养六基培养 7、长江8大—学生种科院子生物罐工程培系 养 9—发酵罐
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发酵级数确定的依据：
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2～4级；
在发酵产品的生产中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
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➢ 获得一定数量和质量的菌丝体：
对于产孢子能力不 强及孢子发芽慢的菌种，可以采用 摇瓶液体培养法，经恒温振荡培养获得菌丝体。
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孢子的制备
① 细菌孢子的制备
◆ 斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 ◆ 培养温度：一般为37˚C，少数28˚C 。
◆ 培养时间：需要5～10天。
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养
基，这有两个方面的原因: 一是成本、二是驯化。
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①生化指标
检测培养液中的糖 氨基氮
3，5-二硝基水杨酸法 斐林试剂法
磷酸盐含量:萃取-磷钼蓝比色法
pH值
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②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
色泽、气味、浑浊度等 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀
种龄年轻：接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整 个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至出现发酵异 常情况；
种龄过老：引起生产能力下降而菌丝过早自溶。
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舒琴， 林产化学与工业，2004
菌种为嗜碱性芽孢杆菌 镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖 2020年7月4日旺星期盛六 期，30小时长开江大始学生出科院现生物芽工程孢系
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3、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工 厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵（二级种子罐扩大培养） 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
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1.0～1.5
12小时产酸 （%）
4.6～5.2
2.6～3.4
发酵周期（h)
32 35
② 糖酸转化率高且稳定
工艺
产酸（%）
三级种子 二级种子
10.93 9.8
糖酸转化率 （%） 59.8
58
单罐产量 (吨） 21
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4、接种量的确定
接种量指移入种子液的体积和接种后培养液体积之 比。 接种量大小取决于生产菌种的生长繁殖速度。过大 过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7～ 15%，而由北京棒状杆菌发酵谷氨酸只需1%。
Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的 形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵Υ亚麻酸 时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
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采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
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需要数量多、代谢旺盛、活力强的种子接入发酵罐中。
□ 菌种的驯化
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优良种子应具备的条件：
菌体浓度及总量能满足大规模发酵罐接种量的要求； 生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等； 生长活力强，移种至发酵罐后，能够迅速生长；
无杂菌污染，保证纯种发酵；
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4、接种量的确定
一般认为大一点好。 采用较大的接种量可缩短菌丝体繁殖达到高峰的时 间，使产物形成提前到来；生产菌占优势，减少杂菌 生长的机会。 接种量过多，往往又会使菌丝生长过快，培养液黏 度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。 接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵 周期延长，菌丝量少，产生菌丝团，导致发酵异常等
（27 °C ~28 °C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐
（15 °C ~20 °C ，3~5天）
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子 培养基应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较 小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都 比较精细。
接种量的确定及对发酵的影响；影响种子质量的因素 及其控制措施。
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内容速览
种子的 扩大培养
4.1目的 与要求
4.2种子制 4.3种子制备 备技术概要 过程举例
1制备 过程
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2实验室 阶段
3生产车 间阶段
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4种子质 量控制
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采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东， 发酵科技通讯，2003,7
背景：近年来，由于谷氨酸发酵产酸水平快速提高，发 酵工艺也在不断改进和创新，国内大多数厂家都采用“大种 量二级种子发酵工艺”（种子罐是发酵罐的5%以上） ，发酵产 酸水平和糖酸转化率比“小种量二级种子发酵工艺”（种子 罐是发酵罐的1%左右）有了较大提高。但是生产水平和糖酸转 化率稳定性较差，发酵平均周期35h左右，没有达到提高设 备利用率和降低生产成本的目的。
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4、接种量的确定
近年来，生产多以加大种子量及采用丰富培养
基作为获得高产的措施。
有的产品采用双种法：两个种子罐接种到一个
发酵罐中，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发
酵单位提高8%；也有的采用倒种法：一部分种子来
源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液，如链
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第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念: 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休
眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的: □ 接种量的需要
□ 缩短发酵时间、提高发酵效率
霉素发酵中，使用倒种比单种发酵单位提高12%。
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接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前 列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功 能。因发酵法生产Υ亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系 列优点，发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
◆ 培养温度：大多数为28˚C，少数37˚C 。
◆ 培养时间：5～14天。
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e.g 产黄青霉菌
原始菌种 斜面试管 获得孢子
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28 ℃ ，4~14天
成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以
下，于4 ℃冰箱保存）。
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