种子的扩大培养

菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
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第二节 种子制备技术概要
一、种子制备的过程
1－砂土孢子 2—冷冻干燥孢子 3－斜面孢子 4—摇瓶液体培养 5—茄子瓶斜面培养 6—202固0年7体月4日培星期养六基培养 7、长江8大—学生种科院子生物罐工程培系 养 9—发酵罐
◆ 培养温度：大多数为28˚C，少数37˚C 。
◆ 培养时间：5～14天。
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e.g 产黄青霉菌
原始菌种 斜面试管 获得孢子
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28 ℃ ，4~14天
成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以
下，于4 ℃冰箱保存）。
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种子的扩大培养
本研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以 明显202影0年7响月4菌日星丝期六体的形态，长从江大而学生影科院响生物菌工程体系 干重和Υ亚麻酸产量2。9
5、种龄(seed age)
种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或 发酵罐时的培养时间。
原则：一般以处于对数生长期的菌丝体较为合适，细 胞活力强，菌体浓度相对较大。具体需实验确定。
1.0～1.5
12小时产酸 （%）
4.6～5.2
2.6～3.4
发酵周期（h)
32 35
② 糖酸转化率高且稳定
工艺
产酸（%）
三级种子 二级种子
10.93 9.8
糖酸转化率 （%） 59.8
58
单罐产量 (吨） 21
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4、接种量的确定
接种量指移入种子液的体积和接种后培养液体积之 比。 接种量大小取决于生产菌种的生长繁殖速度。过大 过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7～ 15%，而由北京棒状杆菌发酵谷氨酸只需1%。
霉素发酵中，使用倒种比单种发酵单位提高12%。
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接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前 列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功 能。因发酵法生产Υ亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系 列优点，发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
② 霉菌孢子的制备
◇ 一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产 品为培养基。
◇ 培养的温度：一般为25～28˚C。 ◇ 培养时间：4～14天。
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③ 放线菌孢子的制备
◆ 一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适 合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约为 1%，氮源不超过0.5%） 。
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4、接种量的确定
近年来，生产多以加大种子量及采用丰富培养
基作为获得高产的措施。
有的产品采用双种法：两个种子罐接种到一个
发酵罐中，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发
酵单位提高8%；也有的采用倒种法：一部分种子来
源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液，如链
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三、生产车间阶段
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，在工厂一般归 为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间 阶段。
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体：
对于产孢子能力不 强及孢子发芽慢的菌种，可以采用 摇瓶液体培养法，经恒温振荡培养获得菌丝体。
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孢子的制备
① 细菌孢子的制备
◆ 斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 ◆ 培养温度：一般为37˚C，少数28˚C 。
◆ 培养时间：需要5～10天。
种龄年轻：接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整 个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至出现发酵异 常情况；
种龄过老：引起生产能力下降而菌丝过早自溶。
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舒琴， 林产化学与工业，2004
菌种为嗜碱性芽孢杆菌 镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖 2020年7月4日旺星期盛六 期，30小时长开江大始学生出科院现生物芽工程孢系
接种量的确定及对发酵的影响；影响种子质量的因素 及其控制措施。
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内容速览
种子的 扩大培养
4.1目的 与要求
4.2种子制 4.3种子制备 备技术概要 过程举例
1制备 过程
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2实验室 阶段
3生产车 间阶段
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4种子质 量控制
Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的 形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵Υ亚麻酸 时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
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采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
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发酵工程 课件
Fermentation Engi欢ne迎ering
光临 第四章 种子的扩大培养
主讲人：夏帆
第四章 种子的扩大培养（2学时）
教学目的：了解种子扩大培养的目的和制备过程；
掌握优良种子应具备的条件；掌握种子制备技术；了 解谷氨酸和青霉素生产的种子制备。
教学重点、难点：发酵级数的确定及对发酵的影响；
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对于不产孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是 获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。
三角瓶摇床培养
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对于产孢子的微生物
➢ 获得一定数量和质量的孢子：
对于产孢子能力 强及孢子发芽、生长迅速的菌种可 采用固体培养基培养孢子，所获孢子可直接作为种子罐 的种子。
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发酵级数确定的依据：
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2～4级；
在发酵产品的生产中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
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整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染
料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和 内含物情况好。
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缬霉素发酵液中氨基氮的测定
氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不 能用一般的酸碱指示剂（包括酚酞），以氢氧 化钠溶液作滴定测量。但可以用甲醛滴定法测 量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基 酸中氨基相互作用，使滴定终点移至pH9.0左 右，在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用。 pH9.0正是酚酞的变色范围，因此，可以用酚 酞作为指示剂，以氢氧化钠溶液来滴定-NH3+ 基上的H+，每释放一个氢离子，就相当于一个 氨基酸。
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3、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工 厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵（二级种子罐扩大培养） 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
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需要数量多、代谢旺盛、活力强的种子接入发酵罐中。
□ 菌种的驯化
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优良种子应具备的条件：
菌体浓度及总量能满足大规模发酵罐接种量的要求； 生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等； 生长活力强，移种至发酵罐后，能够迅速生长；
无杂菌污染，保证纯种发酵；
（27 °C ~28 °C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐
（15 °C ~20 °C ，3~5天）
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子 培养基应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较 小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都 比较精细。
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第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念: 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休
眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的: □ 接种量的需要
□ 缩短发酵时间、提高发酵效率
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养
基，这有两个方面的原因: 一是成本、二是驯化。
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二、实验室阶段
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验 室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成， 因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段。
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质。
根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：
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4、接种量的确定
一般认为大一点好。 采用较大的接种量可缩短菌丝体繁殖达到高峰的时 间，使产物形成提前到来；生产菌占优势，减少杂菌 生长的机会。 接种量过多，往往又会使菌丝生长过快，培养液黏 度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。 接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵 周期延长，菌丝量少，产生菌丝团，导致发酵异常等
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e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌） 原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）
三角瓶培养（摇床）(flask culture)
种子罐培养
e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
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来自百度文库
四、种子质量控制
1、种子质量标准
2、影响种子质量的因素 3、种子质量的控制措施 ４、种子质量异常分析
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1、种子质量标准
①生化指标 ②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 （色泽、气味、浑浊度等） ③检查有无杂菌污染 ④产物生成量 ⑤其他参数
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①生化指标
检测培养液中的糖 氨基氮
3，5-二硝基水杨酸法 斐林试剂法
磷酸盐含量:萃取-磷钼蓝比色法
pH值
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②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
色泽、气味、浑浊度等 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀
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对于不产孢子的赤霉素生产菌 （Gibberelline fujikuroi），也可用大米 固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种 子罐种子。
不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆 菌（Corynebacterium）、短杆菌 （Brevibacterium），生产上一般采用斜 面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养， 获得细胞悬液再接种。
文章：三级种子工艺
斜面→一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）→二级种子（2m3）
→三级种子（20m3)→发酵罐（240m3)
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三级种子的特点：
① 种量更大，生长速度更快，产酸提前且速度快：
工艺
三级种子 大种量二级种子
8小时产酸 （%）
2.2～2.7
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采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东， 发酵科技通讯，2003,7
背景：近年来，由于谷氨酸发酵产酸水平快速提高，发 酵工艺也在不断改进和创新，国内大多数厂家都采用“大种 量二级种子发酵工艺”（种子罐是发酵罐的5%以上） ，发酵产 酸水平和糖酸转化率比“小种量二级种子发酵工艺”（种子 罐是发酵罐的1%左右）有了较大提高。但是生产水平和糖酸转 化率稳定性较差，发酵平均周期35h左右，没有达到提高设 备利用率和降低生产成本的目的。