EPO肽调控巨噬细胞功能及促进炎症疾病康复研究

EPO肽调控巨噬细胞功能及促进炎症疾病康复研究陆军军医大学黄博1，王琛禹1（1．基础医学院学员四大队重庆市400038）（论文于2018年7月在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》杂志发表，IF：4.499）指导教师：张志仁职称：教授中文摘要：【目的】探究促红细胞生成素（EPO）来源的非促造血性衍生肽治疗炎性疾病时，是否具有与EPO相似的功能及作用机制，并避免EPO的促造血副作用，从而拓宽EPO临床应用【方法】流式细胞术（FCM）和Q-PCR体外检测巨噬细胞的炎症反应及吞噬功能；Q-PCR、FCM及组织化学染色检测伤口愈合速率、吞噬及炎症反应情况；分光光度仪、免疫荧光及ELISA检测系统性红斑狼疮（SLE）小鼠体内抗体水平及肾脏功能；FCM检测EPO肽对骨髓造血细胞的影响【结果】（1）EPO衍生肽通过巨噬细胞促进炎症消退及吞噬功能；（2）EPO肽促进伤口愈合；（3）EPO肽改善SLE小鼠症状；（4）EPO肽对骨髓造血功能无影响【结论】EPO衍生肽与EPO具有相似功能及作用机制；EPO肽通过巨噬细胞促进炎症消退及吞噬凋亡细胞；EPO肽促进伤口愈合同时缓解SLE小鼠症状；应用EPO肽不会刺激造血功能，避免EPO的副作用发生。

英文摘要：Due to its haematopoiesis-stimulating effects, the clinical application of EPO can be limited. EPO-derived helix-B peptide (ARA290) is non-erythrogenic but retain the functions of EPO. Therefore, here we investigated the effects and potential mechanisms of ARA290 on wound healing and SLE. ARA290 suppressed the level of serum autoantibodies, ameliorated the nephritis symptoms, and promoted the rate of wound healing. Moreover, the concentrations of inflammatory cytokine and the number of apoptotic cells in mice were reduced. In vitro , ARA290 inhibited the inflammatory activation and promoted the phagocytosis of macrophages. Finally, ARA290 did not induce haematopoiesis. In conclusion, ARA290 ameliorated wound healing and SLE, which could be due to itsanti-inflammatory and phagocytosis promoting effects, without stimulating haematopoiesis, suggesting that ARA290 could be a hopeful candidate for disease treatment.关键词：EPO衍生肽；巨噬细胞；炎症；细胞凋亡国家级大学生创新创业训练计划支持项目（）1作者简介：黄博（1995-）男，山东海阳人，临床医学五年制，2014级，主要从事炎症反应及巨噬细胞的研究；王琛禹（1997-）男，山西忻州人，医学影像学五年制，2014级，主要从事炎症反应及巨噬细胞的研究。

前言巨噬细胞是免疫系统的重要效应细胞，构成机体防御的第一道屏障，参与吞噬、清除微生物和坏死组织；启动组织修复，参与瘢痕形成及纤维化；分泌白介素、肿瘤坏死因子等炎症介质，是启动炎症反应、并使炎症蔓延的重要细胞。

巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬与清除是免疫系统最重要功能之一，能够避免凋亡细胞的二次坏死所导致的细胞膜破裂和细胞内容物的外泄。

吞噬凋亡细胞后，巨噬细胞能够释放抗炎型细胞因子如TGF-β，发挥免疫调控功能，避免了免疫系统对自身抗原的激活和自身免疫的发生，对于保持内环境的稳态十分重要。

巨噬细胞的功能障碍会导致慢性炎症性疾病的发生，如系统性红斑狼疮，慢性伤口不愈合等。

系统性红斑狼疮(SLE)是累及多组织和器官的慢性自身免疫性疾病。

研究发现SLE患者体内巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力较健康人显著降低。

巨噬细胞同时是伤口愈合关键细胞，通过分泌炎症因子调节伤口炎症反应。

研究表明巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能受损，将致使伤口炎症消退障碍造成伤口迁延不愈。

因此，调节巨噬细胞的炎症反应及吞噬功能对于维持内环境稳态，抑制慢性炎症性疾病的发生具有重要意义。

EPO（促红细胞生成素）不仅可以通过与EPOR受体结合用于治疗贫血，同时通过与EPOR2-βcR2结合发挥抗炎、抗凋亡等非促红作用[4]，但EPO与EPOR受体结合能力要比EPOR2-βcR2的结合能力强，因此发挥非促红作用需高剂量，从而导致肿瘤、动脉粥样硬化和血栓等显著的副作用，因此临床应用受到限制。

根据结合受体的差异，目前开发出的EPO衍生物如ARA290已在多种疾病中被证实具有显著效果。

尽管上述对ARA290的研究已取得初步进展，并且具有良好作用，但其具体作用机制尚未见报道[5]。

研究发现EPO可以通过巨噬细胞抑制炎症反应同时促进吞噬功能，发挥治疗疾病作用，那它的衍生肽ARA290是否会发挥相似作用？会以怎样的方式发挥作用？在本课题中，我们在体外通过FCM和Q-PCR等方法对应用ARA290刺激后巨噬细胞炎症反应及吞噬功能进行了检测，体内进一步选用伤口愈合及SLE两种疾病模型作为研究对象，从两个方面研究了其在炎性疾病中的功能及其作用机制，同时探究了ARA290对骨髓造血功能的影响。

结果（一）ARA290促进巨噬细胞炎症消退及吞噬功能1.选用Q-PCR（图1 A，B）检测LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，发现ARA290可以显著抑制促炎因子TNF-α及iNOS的分泌，并呈浓度依赖性2.通STS诱导的Jurkat凋亡细胞与RAW264.7及梯度ARA290共培养4h后，通过FCM（图1.C，D）检测，结果显示凋亡诱导率为67%；同时发现ARA290促进巨噬细胞吞噬功能，并且呈浓度梯度依赖性图1. （A,B）Q-PCR检测ARA290作用后巨噬细胞炎性因子TNF-α及iNOS的表达；（C）流式细胞术检测Jurkat诱导凋亡情况；（D）流式细胞术检测ARA290对巨噬细胞吞噬功能的影响（二）ARA290缓解SLE小鼠症状、改善肾脏功能、促进炎症消退及吞噬功能1.通注射0.5ml降植烷3月后成功诱导SLE小鼠模型（图2.A）；2.通过ELISA（图2.B）检测，发现ARA290同时降低抗核抗体（ANA）及抗dsDNA抗体的水平；3.通过荧光染色（图2.C,D）、分光光度计（图2.F，G），发现ARA290降低肾脏IgG、C3免疫复合物沉积及血清、尿液中的肌酐、尿素氮及白蛋白等含量，说明ARA290可以促进SLE小鼠肾脏功能恢复；4.通过F4/80荧光染色（图2.H），FCM、ELISA（图2.I），发现ARA290抑制肾脏组织巨噬细胞浸润，下调促炎因子的表达、上调抗炎因子TGF-β的表达，说明ARA290抑制SLE小鼠炎症反应；5.通过Tunnel凋亡荧光染色（图2.J），发现ARA290促进SLE小鼠体内凋亡细胞的吞噬清除。

图2. ARA290缓解SLE小鼠症状、改善肾脏功能、促进炎症消退及吞噬功能：（A）成功构建SLE小鼠模型；（B）血清抗核抗体水平；肾脏免疫复合物IgG（C）、C3沉积（D）；（E）肾小球受累情况；（F）血清BNU、肌酐含量；（G）尿液ALB、肌酐及尿素含量；（H）肾脏组织巨噬细胞浸润；（I）炎症因子表达；（J）肾脏组织凋亡细胞数量（三）ARA290促进小鼠伤口愈合速率、胶原沉积、肉芽组织及血管生成、促进炎症消退及吞噬功能1. 成功构建伤口愈合模型（图3.A）2. 通过HE、IF及Masson染色（图3.B-E），发现ARA290干预后，小鼠伤口愈合加快、肉芽组织生成增加、胶原沉积及血管生成数量明显增多，伤口愈合情况显著好转。

3. 通过qRT-PCR、Tunnel凋亡染色（图3.F-G），发现ARA290抑制促炎症因子iNOS、TNF-α的表达，促进抗炎因子TGF-β的表达，下调凋亡细胞数目，说明ARA290促进巨噬细胞的炎症消退及吞噬功能。

图3.ARA290促进小鼠伤口愈合：（A）小鼠伤口愈合模型建立成功；（B）伤口愈合速率；（C）肉芽组织生成；（D）胶原沉积；（E）血管生成；（F）炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1、Arg-1分泌水平；（G）Tunel凋亡细胞数目（四）ARA290不刺激骨髓造血功能通过全血细胞仪、FCM检测外周血中红细胞数目、血红蛋白含量和红细胞压积及骨髓中造血干细胞LT-SHC等含量（图5.A-E），发现应用ARA290并未影响小鼠的造血功能。

图5.小鼠骨髓造血功能结论本文探究了EPO衍生肽与巨噬细胞吞噬及炎症反应之间的关系，并对其中可能的机制及其在伤口愈合及系统性红斑狼疮中的作用及副作用进行了探讨。

得出如下结论：1.ARA290通过巨噬细胞抑制炎症反应、促进吞噬凋亡细胞；2.ARA290促进小鼠伤口愈合；3.ARA290促进SLE小鼠肾脏功能恢复，改善SLE症状；4.ARA290不发挥刺激造血作用，避免EPO副作用的发生。

参考文献[1] Luo B. Erythropoeitin Signaling Promotes Dying Cell Clearance and Immune Tolerance[J]. Immunity, 2016, 44(2): 287-302.[2] Mirza R. Selective ablation is detrimental to wound healing in mice[J]. Am J Pathol, 2009, 175(6): 2454-2462.[3] Li J, Chen J, Kirsner R. Pathophysiology of acute wound healing[J]. Clinics in Dermatology, 2007, 25(1): 9.[4] Koh T J, Dipietro L A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage[J]. Expert Rev Mol Med, 2011, 13: e23.[5] Hanayama R. Autoimmune disease apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice[J]. Science, 2004, 304(5674): 1147-1150.。