大豆蛋白酶解物抗氧化活性及氨基酸组成的研究_许英一

收稿日期：2014-08-24 基金项目：黑龙江省自然科学基金项目(C201456)；黑龙江省科研计划项目(XZNKT14-3)。 作者简介：许英一(1971—)，女，黑龙江依安人，硕士，副教授，主要从事食品科学的研究工作。
[2] 王金恒 , 展现明 , 闫锁 . 玉米蛋白粉中色素及醇溶蛋白的 提取工艺研究[J].安徽农业科学,2009,37:17080-17084 [3] 李梦琴 , 李运罡 , 宋晓燕 . 玉米醇溶蛋白提取工艺的研究 [J].食品工业科技,2008,(1wenku.baidu.com):135-137 [4] 马谦,江莉莉,王书云,等.微波辅助提取玉米醇溶蛋白的
表1 不同酶解条件的大豆寡肽水解度结果
图1 不同DH的大豆蛋白酶解物对DPPH・的清除率
由图1结果可知，不同DH的大豆蛋白解物对 DPPH・清除能力均随底物浓度的增加而提高，当 浓度为2.0 mg/mL时，抑制率在40%~80%之间，显 示出较强的DPPH・清除能力。这是因为，样品浓 度越高，其中所含具有抗氧化性的氨基酸短肽就 越多，从而抗氧化性就越强。 DPPH自由基的清除力也随着DH的增大而逐 渐增大，当DH为18.21%时达到最高(72.86%)，之 后随着DH的升高而逐渐下降。这说明酶解产物的 抗氧化性与其DH有关，水解度大小对肽段长短和 游离氨基酸的相对含量是至关重要的，如水解度 太小，则肽段过长，具有抗氧化性的一些氨基酸 未能断裂而呈现在肽段的N-末端和C-末端，抗氧 化性显示不出；如水解度太大，游离氨基酸含量 过高，抗氧化性则降低。所以，控制适当的水解 度可以获得不同抗氧化性活性的大豆肽。 2.3 氨基酸分析 本文对6种不同水解度(DH)的大豆蛋白酶解
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提取物与应用
大豆蛋白酶解物抗氧化活性及 氨基酸组成的研究
许英一，王晓杰，吴红艳，孙天颖 (齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室， 齐齐哈尔 161006)
摘要 ： 以大豆蛋白粉为原料 ， 利用碱性蛋白酶水解制备寡肽 。 研究了不同水解度 (DH) 的大 豆蛋白酶解物抗氧化活性及氨基酸组成 。 结果表明 ： 在酶解物浓度为 2 mg/mL 时 ， 水解度 为 14.05% 、 15.98% 、 17.18% 、 18.21% 、 21.04% 、 24.12% 的大豆寡肽溶液对二苯代苦味肼基 自由基 (DPPH・) 清除能力呈现先逐渐上升后下降的趋势 ， 水解度为 18.21% 时 ， 大豆寡肽对 DPPH・清除作用最强为72.86%。经氨基酸分析，不同水解度的大豆蛋白酶解物均含有较高比 例的必需氨基酸，含量在24%~30%之间。必需氨基酸(EAA)含量、总氨基酸(TAA)含量、必需氨 基酸占总氨基酸的含量(E/T)、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)均随水解度的增大呈现先 增加后减小的趋势，表明其抗氧化活性与氨基酸组成存在一定关系。 关键词：大豆蛋白；碱性蛋白酶；水解度；抗氧化活性；氨基酸 中图分类号：TS 201.4 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)01-0267-04
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大豆蛋白粉配制成一定底物浓度的反应体系，置 于温度为50 ℃水浴中预热处理30 min。处理后调 节至碱性蛋白酶适宜的反应温度和pH值。随着水 解反应的进行，酶解液的pH值逐渐下降，滴加 0.5 mol/L NaOH溶液保持蛋白酶最适pH值不变， 间隔一定时间记录消耗NaOH溶液用量。酶解结束 后，将酶解液放入100 ℃沸水中灭酶保持10 min。 取出，迅速冷却，4000 r/min离心20 min，取上清 液，冷冻干燥，同时根据NaOH溶液用量，计算不 同酶解条件的蛋白质水解度。 本实验进行了2个单因素实验： 配制底物浓度为5%的大豆蛋白溶液，将pH 值分别控制在7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，温度为50 ℃，酶添加量1000 U/g，水解4 h，灭酶、离心取 上清液冻干。计算其水解度。 配制底物浓度为5%的大豆蛋白溶液，将温度 分别控制在45、50、55、60、65 ℃，pH值为8.0， 酶添加量1000 U/g，水解4 h，灭酶、离心取上清 液冻干。计算其水解度。 1.2.2 对二苯代苦味肼基自由基(DPPH・)清除能 力的测定 研究不同水解度(DH)的碱性蛋白酶酶 解产物对DPPH・的清除能力的影响，初步确定水 解度与抗氧化活性的关系。 1.2.3 氨基酸营养评价 测定不同DH的碱性蛋白 酶酶解产物的氨基酸组成，通过比较酶解产物的 必需氨基酸含量、总氨基酸含量探讨水解度、氨 基酸组成和抗氧化活性之间的关系。 1.3 测定方法 1.3.1 水解度的测定 采用pH-Stat法[3]。 1.3.2 蛋白质含量测定 采用微量凯氏定氮法[4]。 1.3.3 二苯代苦味肼基自由基(DPPH・)清除能力 的测定 参考Shimada [5]的方法略作改动：各取2
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.01.056
The antioxidant activities and the amino acid analysis of soybean protein hydrolysates
XU Ying-yi, WANG Xiao-jie, WU Hong-yan, SUN Tian-ying
研究[J].粮油加工,2009,(8):91-94 [5] 吴亚梅 , 陈建 , 李维峰 . 玉米蛋白粉深加工应用的新进展 [J].现代食品科技,2007,23(4):98 [6] 吴磊燕 . 玉米醇溶蛋白改性 、 界面特性及成膜性研究 [D].广州:华南理工大学,2010
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提取物与应用
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性，以探讨水解度与抗氧化活性之间的关系。 大多数自由基反应活性较强而寿命短暂， DPPH・是为数不多的即使在室温条件下也能保持 稳定的自由基，用DPPH・清除能力反映被测物的 抗氧化活性操作简便、快速、灵敏。因此本研究 考察了不同DH的碱性蛋白酶酶解产物对DPPH・ 的清除能力的影响，其结果见图1。
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提取物与应用
mL待测样品溶液(质量浓度为0~2.5 mg/mL)，依次 与2.0 mL浓度为0.04 g/L的DPPH・无水乙醇溶液室 温避光反应30 min，在517 nm处测吸光值Ai。另取 2 mL待测样品与2 mL无水乙醇避光反应20 min， 在517 nm处测吸光值Aj；以2 mL 0.04 g/L DPPH无 水乙醇溶液和2 mL无水乙醇反应作为参比，其吸 光值为A0。按照下列公式计算待测样品对DPPH自 由基的抑制率：
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different degree of hydrolysis (DH) are studied. The results show that the concentration of enzymatic hydrolysate of 2 mg/mL, scavenging activity of the soybean oligopeptide solution of DH 14.05%, 15.98%, 17.18%, 18.21%, 21.04%, 24.12% against DPPH radical first gradually increased and then decreased, DH is 18.21%, scavenging activity of soybean protein hydrolysates against DPPH radical is the highest (72.86%). Soybean protein hydrolysates with different DH contain a higher proportion of the essential amino acids, contents are 24%~30%. The essential amino acid (EAA) content, total amino acid (TAA) content, the ratio of essential amino acid and total amino acid content (E/T), the ratio of essential amino acid and nonessential amino acid (E/N) are increased first and then decreased with the degree of hydrolysis increases, It shows that there is a certain relation between the antioxidant activities and the amino acid analysis. Key words: soybean protein; alcalase; degree of hydrolysis; antioxidant activity; amino acid
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1.3.4 氨基酸含量的测定 采用氨基酸全自动分析 仪(日立L-8900型)酸水解法测定，适量样品中加入 6 mol/L盐酸后封管，于105 ℃烘箱中水解24 h，测 定大豆蛋白酶解物中17种氨基酸含量。 2 结果与分析 2.1 碱性蛋白酶水解大豆蛋白制备寡肽 在2个单因素实验中，本论文选择了水解度有 一定差异的6个大豆蛋白酶解物。其酶解条件及水 解度结果见表1。
Abstract: Based on soybean protein as experiment material, the oligopeptide is produced by hydrolysis of alcalase. The antioxidant activities and the amino acid analysis of soybean protein hydrolysates with
大豆蛋白酶解产物具有较高的营养价值和 功能特性，如降血压、促进生长、抗凝血、抗氧 化、增强免疫力等[1]，因此已被广泛应用于饲料、 食品、化工、医药等各个领域。Chen [2]等研究表 明大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活 性肽，这类活性肽能抑制机体内自由基的大量积 累，对提高自由基清除机制起到一定功效，延缓 机体的衰老。酶解条件的选择对于大豆蛋白酶解 物的功能非常重要。不同酶解条件制备大豆蛋白 寡肽其氨基酸组成及风味亦有很大的差别。本研 究采用碱性蛋白酶对大豆蛋白进行不同条件的水 解，得到不同水解度的大豆蛋白酶解物，分析不 同酶解物的抗氧化活性及氨基酸组成，以期为下 一步开发和利用大豆蛋白提供实验依据和参考。 1 材料与方法 1.1 材料与设备 大豆蛋白(蛋白质含量82.23%)：市售；碱 性蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司，酶活 力10万u/g；二苯代苦味肼基自由基(DPPH・)： Sigma公司；无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、盐 酸、柠檬酸三钠等：天津市凯通化学试剂有限公 司，分析纯。 DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型制造 厂；80-1台式低速离心机：上海安亭科学仪器 厂；PHS-25(数显)pH计：赛多利斯科学仪器北京 有限公司；FD-1真空冷冻干燥机、SHZ-82水浴恒 温振荡器：金坛市亿能试验仪器厂；722N可见分 光光度计：上海精密科学仪器有限公司；L-8900 全自动氨基酸分析仪：日立Hitachi公司。 1.2 实验方法 1.2.1 碱性蛋白酶水解大豆蛋白制备寡肽工艺 将
(College of Food and Bioengineering, Qiqihar University, Key Laboratory of Processing Agricultural Products, College of Heilongjiang Province, Qiqihar 161006)