生物工程下游技术实验讲义

生物工程下游技术实验讲义

目录

实验一层析柱装填及柱效测定

实验二溶菌酶粗提取

实验三溶菌酶分离纯化

实验四酶活力及蛋白质浓度的测定

实验五溶菌酶纯度鉴定与分子量测定

实验一层析柱装填及柱效测定

一、实验目的

1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；

2. 熟悉凝胶层析的一般过程；

二、实验原理

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。三、实验试剂与器材

层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），水浴锅，蓝色葡聚糖

四、实验内容与步骤

（一）测量层析柱的内径、高度，计算所需凝胶量

干胶用量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)

由上式计算出的干胶用量再增加10%-20%

（二）Sephadex G-50凝胶预处理

称取相应质量的干凝胶，加入适量的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。

（三）层析柱的装填

1 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。

2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。

3. 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的缓冲液

4、边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉降，并不断加入凝胶液，最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，关闭出水口。

5、柱子装好后，用缓冲液平衡柱子。用15ml洗脱剂走柱子使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min) 始终保护凝胶上端有一段液体。（注意不能干柱、分层、否则需重新装柱）（四）凝胶柱柱效测定

1 肉眼观察，柱子填装是否均匀，无纹路，无气泡

2 用0.5ml 2mg/mL的蓝色葡聚糖-2000上柱，如果色带狭窄、平整、均匀下降，表明柱中的凝胶填装情况较好，可以用来进行样品分离。如果色带分散，歪曲，则需重新装柱。（五）凝胶再生

鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。

五、注意事项

1. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。

2. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

3. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失

六、背景资料

凝胶层析的使用

（一）层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用20-30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm 左右长的层析柱，其直径在1-5cm 范围内，小于1cm 产生管壁效应，大于5cm 则稀释现象严重。

由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱(一般制备用凝胶柱，直径大于2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1m。

⑴分组分离时用短柱，一般凝胶柱长20－30cm ，柱高与直径的比较5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于凝胶床体积为的20% 。

⑵分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000 ），样品溶液体积应小于凝胶床体积为的 5 % 。

⑶脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25 或Bio-Gel-p-2、4、6 。柱长与直径之比为5-15 ，样品体积可达柱床体积的20-25% ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。（二）凝胶的类型

常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：

种类及主要用途化学组成部分型号颗粒大小（/目数）分离性能（Da）溶胀时间/h 20-25℃90-100℃

葡聚糖凝胶（Sephadex G-）由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成

G-10 100-200 ＜700 3 1

G-15 120-200 ＜1500 3 1

G-25 50-400 100-5,000 3 1

G-50 50-400 500-30,000 3 1

G-75 120-400 1,000-8,000 24 3

G-100 120-400 1,000-15,000 72 3

G-150 120-400 1,000-30000 72 5

G-200 120-400 1,000-60,000 72 5

聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel p-）由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成

P-2 50-400 200-1,800 4 2

P-4 50-400 800-4,000 4 2

P-6 50-400 1,000-6,000 4 2

P-10 50-400 1,500-20,000 4 2