正常血细胞形态观察

正常血细胞形态观察

实验准备

一．器材：

载玻片

盖玻片：

滴管：4个

橡皮吸头：4个

玻璃棒：4根

烧杯：1000 ml，2个

量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一

蜡笔

棕色小口瓶

碾钵

载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。

二．试剂：

瑞氏染液240ml

瑞氏染料粉剂 0.1g

纯甲醇（AR） 60ml

将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，

然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。染料存放越久，染色效果越好。

磷酸盐缓冲液

1%KH2PO4 30ml

1%Na2HPO4 20ml

加蒸馏水至800 ml，调PH值到6.5~7.0，定容至1000ml。

甲醇

二甲苯

实验步骤

一．涂片

（一）血液涂片的制作

（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。

（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。

（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。

（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。

（6）每只动物涂片一张。

（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。

（8）置30min～1hr后较利于观察红细胞的形态。

注意事项：

●如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片

另一端2cm地方涂抹为宜。

●载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。

在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30°而是35°～40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。

●如用力过猛白细胞容易破损。

二．染色

（一）血液涂片的染色

（1）将待染涂片平放于染色架上。

（2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1～3分钟。

（3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻

吹之，使之混匀，室温下染色5～10分钟（白细胞数多或

骨髓标本时间应长一些，如20～30min）。

（4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。

（5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。

（6）甩干或晾干玻片。

（7）封片。

【染色原理】

1．瑞氏染料

是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。美蓝（又名亚甲蓝mehyleme blue）为四甲基硫堇染料，通常为氯盐，即氯化美蓝。伊红（又名曙红eosin）通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀，即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。2．细胞的染色

既有物理性的吸附作用又有化学的亲和作用，各种细胞和细胞的各种成分化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样，因此用染色液染色后在同一血片上可以看见不同的色彩。

例如：

➢血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白，与酸性染料伊红结合染成粉红色称为——酸性物质。

➢细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，

染蓝色或紫色称为——碱性物质。

➢中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合，染紫红色称为——中性物质。

3．PH对细胞染色的影响

细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多易与伊红结合染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝，因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，在染色过程中玻片必须清洁，配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗水应近中性，否则各种细胞染色反应异常，致使细胞的识别困难，甚至造成错误。

【血细胞发育规律】

血细胞在分化成熟过程中，其形态和大小的变化基本上有一个共同的规律：

1．胞体：随着血细胞的发育成熟，胞体由大逐渐变小，但巨核细胞系统则由小变大，原始粒细胞至早幼粒细胞也逐渐由小变大。2．胞核

（1）大小：由大变小，但红细胞系统例外，成熟红细胞核消失。（2）形状：圆形变为不规则形；粒细胞核呈分叶状；淋巴与浆细胞系统变化不大。

（3）染色质：细致、疏松逐渐变为粗糙、紧密。

（4）核膜：不明显变为明显；原淋巴细胞核膜最厚；原幼粒细胞核膜最薄；原始单核细胞介于两者之间。

（5）核仁：由有至无。清楚的核仁是原始和比较原始细胞的重要标记，呈淡蓝色，随着细胞的成熟而消失。

3．胞浆

（1）量：有少到多。

（2）颜色：深蓝到浅蓝，见于淋巴细胞与浆细胞。红细胞与粒细胞的胞浆各逐渐变成桔红和粉红色。

（3）颗粒：一般从无到少并逐渐增多。粒细胞系统由少量的嗜天青颗粒逐渐代之以大量中性、嗜酸和嗜碱颗粒。

（4）胞核与胞浆体积之比：由大到小。

血涂片的观察方法

1．肉眼观察

在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。如果是正常的末梢血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨髓瘤的高γ球蛋白血症等情况下，血涂片会带有蓝色（如下图1-4-1），此时应意识到为异常标本。

2．高倍镜下观察

首先观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。最后对血涂片的体尾交界的区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠、标本不太厚容易观察的地方进行油镜