第六章 核酸的研究技术

1. 生物素标记核酸探针 Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、 Bio-16-dUTP等。 2. 地高辛（Dig）标记核酸探针
四、 核酸分子杂交技术
（一）类型：根据反应环境分为 1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定 在固体支持物上，另一条核酸 链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游 离在液体中。
①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。
注意：
①待测核酸顺序与探针顺序同源性高 的杂交，用水溶液时取68℃，用50% 甲酰胺溶液时取40℃。 ②待测核酸顺序与探针同源性不高时， 以50% 甲酰胺溶液在35—40℃杂交。
5. 核酸分子的复杂性直接影响复性几率。 6. 非特异性杂交反应：在杂交前将非特异 性位点进行封闭，以减少对探针的非特异 性吸附作用。 常用封闭物： ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA ②高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉
（三）操作过程
蛋白的制备
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SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离不 同的蛋白质
蛋白印迹
载体
+阳极
-阴极
多孔垫片 滤纸 凝胶
封闭
杂交（一抗与特定蛋 白结合）
漂洗去除多余的 一抗
二抗与一抗结 合
结果检测
第二节 核酸的测序技术
一、Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method)
（四）探针标记物的选择
理想的标记物： ①具有高度的灵敏性 ②与探针结合后，不影响杂交及探针的主 要理化特性 ③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率 低，环境污染少，价格低廉；
④若用酶促方法标记，应对Km影响不大
常用的放射性标记物
1. 常用探记探针的同位素： 32P、3H、35S、14C、125I、131I
2. 特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱 基配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
3. 探针标记的方法
①缺口平移法（nick translation） 实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链 中不带同位素的同种核苷酸，生成的两 条链均被同位素标记。
三、核酸探针
（一）探针的选择原则 1. 高度的特异性 2. 制备探针的难易性和检测手段的灵敏法 （二）探针的种类
1. 基因组DNA探针
从基因组DNA文库中选取某一基因片段
↓
与载体连接（质粒、噬菌体）
↓
克隆(PCR扩增)
↓
酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解 （与RNA比较）；③标记方法成熟。
3ˊ→5ˊ外切酶 5ˊ→3ˊ聚合酶
—C
Klenow片段（67000）
5′—GAATTC—3′ 3′—CTTAAG—5′
EcoRⅠ 5′——G 3′——CTTAA AATTC——3′ G——5′ Klenow, dNTP,[α-32P]dATP 5ˊ——GAATT 3ˊ——CTTAA AATTC——3ˊ TTAAG——5
常用的非放射性标记
优点：无环境污染，可较长时间贮存 方法：1.酶标记法 2.化学标记法 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异 亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响 甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛 （digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、 补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）
第六章 核酸的研究技术
第一节 核酸分子杂交（nucleic acid
hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定条 件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
一、变性与复性 DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
吸水纸 滤纸 载体
凝胶 缓冲液
固定到载体
2. Northern印迹杂交 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到 NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质 印迹技术则被称为Western blotting。
3. 斑点杂交（dot blot ）(线状圆形)
4.原位杂交（in situ hybridization） 直接用探针与细胞或组织切片中的 核酸杂交。 应用：1）观察基因在组织中的表达 2）确定基因在染色体中的定位
原 理
在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引 物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补 的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）, 由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不 能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种 全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结 尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙 烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链 DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(annealing)。
（二）固体支持物种类
硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、 微孔板等。 选择原则：
① 具有较强的结合核酸的能力； ② 与核酸的结合比较稳定 ③ 尽量少的非特异性吸附
（三）常用固相杂交类型
Southern印迹杂交、Northern印迹杂、 菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、 组织原位杂交、夹心杂交等。
1. Southern 印迹杂交 主要步骤：
纯化的待测DNA样品 限制性内切酶酶切后（EDTA， 65℃灭活限制酶） 琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 变性液（碱变性）
凝胶上DNA变性
Tris缓冲液 中和 高盐下
预杂交 杂交 放射自显影 结果分析
DNA转印至NC膜
烘干、固定
southern印迹
2. cDNA探针（complementary
DNA）
通过逆转录 ↓ 双链cDNA
优点： 不含内含子及高度 重复序列但不易获得
↓S1核酸酶切平两端 加接头 ↓限制酶 粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆
3. RNA探针：检测DNA和
mRNA
优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂
This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3' carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.
• 核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由 于具有互补序列，在一起复性时，互补 序列配对，形成杂化分子。
+
+
二、影响杂交的因素
1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑
4. 杂交液中的甲酰胺
甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：
附：蛋白免疫杂交
（一）蛋白质的免疫印迹（western) 场所：硝酸纤维素膜 待检分子：蛋白 探针：抗体 杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转 印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与 蛋白杂交，检测特定的蛋白。
（二）所用抗体 1、一抗：针对待测分子的抗体 2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性 同位素或生物素
减色效应：
变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
1. 常用的变性方法： ① 热变性
② 酸碱变性
③ 化学试剂变性
2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA) 识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ Tm值的估算 ① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% ③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）
4. 寡核苷酸探针 优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长 度只有10—50bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂 交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。
（三）探针设计原则：
①长度：10~50bp ②碱基成分:G+C含量为40%~60% ③探针分子内无互补序列。 ④避免同一碱基重复出现。 ⑤ 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因 序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应 超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。
②随机引物法（random priming）
人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列 顺序的混合物，它们可以随机地互补到 DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow 片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA 链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即 可形成放射性同位素标记的DNA探针，但 探针DNA序列是长短不等的。
5. 菌落原位杂交（colony situ hybridization） 将细菌从平板转移到NC膜上
裂解细菌释出DNA
烘干 杂交
（四）核酸杂交的应用 在医学研究与实践中，核酸杂交主要用 于基因诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血 的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速 鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型 及亲子鉴定
优点：比活度高，结果稳定
③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ
末端
5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ 碱性磷酸酶(AKP） 5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ [γ-32P]ATP T4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）
5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ
④Klenow片段快速标记DNA探针末端
用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链 N— 5ˊ→3ˊ外切酶 小片段(36000)
Sanger 双脱氧链终止法
1.双脱氧终止法测序反应体系包括：
DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)
2.Sanger法DNA测序的试剂
① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8 到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发 卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP
3.测序反应的种类
① 引物标记法(Dye primer reactions)
② 终止物标记法(Dye terminator reactions)
Dye primer reactions
• -fluorescent dye( label) on the primer, one specific dye for each nucleotide to be identified (A, C. G, T) • -four separate reactions couple each specific primer with the corresponding ddNTP