实验十一 Southern杂交分析

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分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。

DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。

最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。

对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。

一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。

通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

实验十一 Southern杂交分析

有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。 4、碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜），烘烤（尼龙膜）
那么将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。

DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液洗涤缓冲液；马来酸缓冲液检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷杂交袋或杂交管，注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注意：较长的孵育时间（最高达 20 小时）能够提高地高辛标记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃）这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。

Southern杂交实验

Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。

如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。

Southern杂交方法

分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。

膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。

其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。

再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。

最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。

由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。

Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。

（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。

四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。

然后将凝胶置于一搪瓷盆中。

（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。

留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。

Southern 印迹杂交实验报告

Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。

老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。

总体积20μL。

37℃保温1.5小时。

2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。

浇板，水平放置，待凝。

胶凝后按照以下顺序加样。

两组共用一块凝胶，共7个样。

①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。

Southern 杂交试验方案—本实验室

Southern 杂交试验方案一、探针标记1、探针标记严格按照罗氏试剂盒说明书进行；2、标记探针检测：取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。

由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。

所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。

如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。

用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。

如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。

二、基因组DNA酶切1、采用EcoRI和一对甲基化敏感同裂酶HPaIl、MspI消化高粱基因组DNA 5ug，3 Unit/ug DNA，50uL反应体系，在37℃条件下酶切消化10h。

2、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压小于1v/cm，12h）分离。

凝胶在0.2mol/L的HCl 中脱嘌呤处理，至溴酚蓝变为黄色，弃去HCl后用蒸馏水洗几次，然后以0.4mol/L的NaOH 为转移液，利用毛细管作用将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上，转移过夜后将膜取出夹放于滤纸间，80℃烘烤2小时。

常温放于干燥处保存备用。

（转膜：1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。

（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）3、用蒸馏水冲洗2 次。

加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。

分子生物学实验的常见问题与解决方案范文

分子生物学实验的常见问题与解决方案范文一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。

问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。

向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。

利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，对于大于15kb的DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。

如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。

另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。

转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。

2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTriHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。

southern杂交技术

Sourthern杂交技术摘要：使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。

以含有外源基因的水稻转基因植株叶片为材料，CTAB法少量抽提总DNA，总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上，最后与地高辛标记的探针进行杂交。

通过条带的有无来判断是否为含有外源基因的转基因植物，条带的多少反映了转基因植株中外源基因的拷贝数。

结果：关键词：抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。

但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。

但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标记系统试剂盒等。

1.2水稻总DNA的少量抽提CTAB法抽提DNA步骤：(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5⨯CTAB，混匀；(3)65ºC水浴中放置30分钟以上，每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；(4)12000g离心2分钟；(5)吸取600μl上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色；(6)12000g离心5-10分钟；(7)吸取450μl上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现；(8)12000g离心10分钟；(9)弃去上清，用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上清,自然干燥；(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA），放于4ºC溶解；(11)充分溶解后，测定并调整浓度。

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交Southern印迹杂交实验原理核酸分⼦杂交技术是分⼦⽣物学领域中最常⽤的具体⽅法之⼀。

其基本原理是：具有⼀定同源性的两条核酸单链在⼀定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是⾼度特异的。

由于核酸分⼦的⾼度特异性及检测⽅法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分⼦的限制图谱。

但为了进⼀步构建出DNA分⼦的遗传图，或进⾏⽬的基因序列的测定以满⾜基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分⼦中基因编码区的⼤⼩和位置。

有关这类数据资料可应⽤Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：⼀是将待测定核酸分⼦通过⼀定的⽅法转移并结合到⼀定的固相⽀持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;⼆是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在⼀定的温度和离⼦强度下退⽕，即分⼦杂交过程。

该技术是1975年英国爱丁堡⼤学的E.M.Southern⾸创的，Southern印迹杂交故因此⽽得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经⽑细管的虹吸作⽤，转移到硝酸纤维膜上。

近年来印迹⽅法和固定⽀持滤膜都有了很⼤的改进，印迹⽅法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如AP T、ABM纤维素膜）等。

利⽤Southern印迹法可进⾏克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某⼀基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性⽚断长度多态性分析（RFLP）等。

实验⽅法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

⼀、待测核酸样品的制备（⼀）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。

1. 采⽤适当的化学试剂裂解细胞，或者⽤组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. ⽤蛋⽩酶和RNA酶消化⼤部分蛋⽩质和RNA；3. ⽤有机试剂（酚/氯仿）抽提⽅法去除蛋⽩质。

（⼆）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成⼤⼩不同的⽚段之后才能⽤于杂交分析，通常⽤限制酶消化DNA。

southern杂交和northern杂交的原理和应用

Southern杂交和Northern杂交是两种常用的分子生物学技术，它们主要通过探针与DNA序列互相配对来检测目标DNA片段是否存在，并确定其大小和数量。

Southern杂交：Southern杂交是一种检测DNA序列的技术，它利用DNA探针与杂交物中的目标DNA 特异性结合，来检测目标DNA序列的存在和数量。

这种方法一般应用于DNA分子量较大的靶标（如基因、整个染色体等）的检测，可以用于鉴定基因的剪接等多种分子生物学研究。

Southern杂交的原理是将DNA样本在电泳板上进行电泳分离，然后用互补的DNA探针杂交分离出目标DNA，在膜或凝胶上通过探针与目标DNA结合来检测。

Northern杂交：Northern杂交是一种检测RNA序列的技术，它利用RNA探针与杂交物中的目标RNA 特异性结合，来检测目标RNA序列的存在和数量。

这种方法一般应用于研究基因表达调控、细胞信号转导和病理生理等方面。

Northern杂交的原理与Southern杂交类似，也是先将RNA 样本在凝胶上进行电泳分离，然后用互补的RNA探针进行杂交分离出目标RNA，在膜或凝胶上通过探针与目标RNA结合来检测。

Southern杂交和Northern杂交的应用：Southern杂交和Northern杂交技术广泛应用于分子生物学、遗传学及生命科学领域。

它们可以用于：1. 检测基因的表达和剪接变异等2. 研究基因家族和功能3. 鉴定细胞中的某一DNA或RNA序列的存在4. 研究基因转录和翻译的调控机制5. 检测突变或重组基因的存在6. 进行基因诊断和疾病基因筛查等除了上述的应用外，Southern杂交和Northern杂交技术还可以广泛应用于以下领域：1. 植物和动物遗传图谱的构建：能够通过探针与DNA或RNA序列的配对来研究基因表达、调控和功能等信息，对于植物和动物的遗传图谱构建有重要的意义。

2. 生物安全监测：利用Southern杂交和Northern杂交技术可以检测到转基因食品或者是非法贩卖的野生动物制品等违法行为，具有重要的生物安全监测作用。

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。

有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。

近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。

利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。

1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。

（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。

鱼类嗅觉基因的Southern杂交分析研究【开题报告】

毕业论文开题报告生物工程鱼类嗅觉基因的Southern杂交分析研究一、选题的背景与意义鱼类的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊构成，鱼类嗅觉器官的进化与发展也经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的过程。

鱼类的嗅觉器官在鱼类的生活中，诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上发挥着重要的作用。

本研究主要利用Southern印迹杂交技术检测本实验室已经鉴定出9个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。

二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：1、从大黄鱼内脏或肌肉组织中提取DNA，并电泳检测DNA的浓度；2、用两种酶（HindIII和E.coliI）酶切目的DNA；3、地高辛标记的探针制备；4、探针与目的DNA的Southern blot杂交；5、杂交膜的洗脱和显色。

拟解决的问题：1、大黄鱼DNA的提取；2、地高辛标记探针的制备；3、电转法转膜的效率；4、杂交膜的洗脱与显色的控制。

三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1. DNA的提取和回收从大黄鱼的肝脏或肌肉组织中提取适量基因组DNA；2.随机引物法标记探针分别用两种酶（E.coli1,Hind3）酶切大黄鱼基因组DNA，电泳胶回收目的DNA片段，制作地高辛标记探针；3.电转法转膜采用电转法将目的DNA片段转移到尼龙膜上（80V，50min）；4.Southern blot膜烘干（120℃,30min）后，先用预杂交液进行预杂交，再用DIG标记探针杂交过夜；5.杂交膜的洗脱和显色杂交完毕，经洗膜后，再用抗体与DIG标记探针杂交，再次用washing buffer洗膜后，即可加入显色剂，将被显色剂充分浸透的杂交膜装入一封闭的袋子中，并置于暗室显色过夜。

显色完全后，查看膜上的条带从而获得相应家族基因的拷贝数，最后将膜烘干并拍照。

这样用9种不同的DIG标记探针就可以获得大黄鱼嗅觉基因系统9大家族基因的拷贝数。

DIG探针的Southern 杂交

PCR产物的Southern 杂交鉴定
【实验目的】
1．了解Southern 杂交的基本原理及其应用。 2．掌握地高辛标记探针的Southern杂交的基本方法。
【实验原理】
1.探针合成： 1.1 PCR方法
变性后的线性 DNA
Байду номын сангаас
Taq酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 特异引物
【实验原理】
1.探针合成： 1.2 随机引物法
变性后的线性 DNA
Klenow酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 随机引物
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
标记点样孔
切胶
凝胶
重物吸水纸厚滤纸保鲜膜转移缓冲液支持物
吸水纸
玻璃板
尼龙膜凝胶厚滤纸
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
－ +
－ +
－
+
紫外交联
尼龙膜
吸水纸
3.探针杂交：
a.预杂交
尼龙膜
预杂交液
b. 杂交
加入已变性的探针
适宜的杂交温度
适量的探针
适宜的杂交时间
4.检测反应 a.加入抗DIG-AP抗体（偶联了碱性磷酸酶的抗地高辛抗体）
加入抗体
4.检测反应 b.加入CSPD ready_to_use CSPD (ready to use)
4.检测反应 c.曝光，记录结果
GnRH
β-actin

Southern杂交技术

一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测
显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类：
– 酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
– 荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。 – 化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。 – 电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检
二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖

三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑥探针标记 –随机引物法 –缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) –末端标记法 • 碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ-32p]-ATP标记 DNA/RNA-5′ • 末端转移酶（poly(N*)n） • T4DNA聚合酶/Klenow片断（粘末端补平）
同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。

Southern杂交分析原理和操作

Southern杂交分析原理和操作【原理】Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。

其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。

通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

一．基因组DNA的限制酶切【操作】DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl) 5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。

消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。

如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。

或者放大反应体积,或者补充酶再消化。

如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。

消化后的DNA 加入1/10体积的0.5mol/L EDTA,以终止消化。

然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。

如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。

二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳【操作】1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2. 电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。

1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。

电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。

取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。

在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。

正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。

三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物【操作】1.碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。

southern杂交原理的应用

Southern杂交原理的应用1. Southern杂交的基本原理Southern杂交是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在给定样本中的存在与表达情况。

它基于DNA的互补配对原理，通过将待测DNA与已知DNA序列进行杂交反应，然后通过检测反应产物来确定目标DNA是否存在。

Southern杂交实验通常包括以下步骤：1.DNA提取：从待测样品中提取DNA，并经过酶切等处理，将复杂的DNA样品变成易于分析的特定DNA片段。

2.DNA电泳：将DNA样品根据大小分子量在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以得到待测DNA片段。

3.DNA转移：将电泳分离后的DNA片段转移到膜上，通常是通过电泳转移（electroblotting）或吸附转移（capillary blotting）的方式。

4.杂交：将已知DNA序列与待测DNA膜进行杂交反应，其中已知DNA序列可能是标记过的探针（probe）或同源基因组DNA。

5.检测：通过封闭法（i.e., 冷光法或放射性法）或非封闭法（i.e., 荧光原位杂交法）来检测杂交反应产物，从而确定目标DNA是否存在。

2. Southern杂交的应用Southern杂交技术在分子生物学和基因组学的研究中有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：2.1 基因组DNA定量Southern杂交可用于检测和定量目标基因组DNA的存在。

通过使用特定探针，可以确定基因组中的某个DNA序列是否存在，并通过探针的信号强度来评估该序列在基因组中的数量。

2.2 基因突变分析Southern杂交可用于检测基因组DNA中的突变。

通过与野生型DNA进行杂交，可以检测突变DNA片段的变化，从而识别基因突变。

2.3 基因拷贝数分析Southern杂交可用于检测基因拷贝数的变异。

通过与标准DNA进行比较，可以确定目标DNA的拷贝数，并评估在不同个体或物种之间的差异。

2.4 基因组同源性分析Southern杂交可用于研究不同物种或个体之间的基因组同源性。

Southern印迹杂交作业指导书

Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。

实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。

Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。

这里主要介绍目前常用的电转法。

电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。

一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。

常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。

实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。

2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。

3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。

4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。

5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。

杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。

2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。

3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。

4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。

5．0.1×SSC溶液。

southern杂交实验方法和步骤

southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机恒温水浴锅Orbital shaker 恒温摇床Poner PAC300核酸电泳仪VersaDoc凝胶成像系统水平摇床HL-2000 Hybrilinker分子杂交仪烘箱二、主要材料whatman 3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板三、主要试剂RNase A真菌基因组提取试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit IDNA MakerNaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸四、试剂准备变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl；Southern blot中和液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5 mol/L NaCl；20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；2×SSC：取100 mL 20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；2×SSC+0.01%SDS：取100 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；0.5×SSC0.01%SDS：取25 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；洗涤缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.3% （v/v）Tween 20；马来酸缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；检测缓冲液：0.1 Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5；封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。

Southern杂交

Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。

（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。

Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。