实验十一 Southern杂交分析
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1、配制0.8%或者1.0%的琼脂糖凝胶，注意胶的厚度和胶孔大小是否合适，在能满 足需要的情况下，胶浓度越低、胶越薄越好。
2、点样，基因组DNA酶切电泳一般用λ/HindIII作为DNA分子量标记。建议干点，即 先加入与凝胶持平的新的电泳缓冲液，使胶孔里没有液体是点样，之后电泳至 样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1-2mm。
有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。 4、碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
带正电荷的尼龙膜
注：所有操作均需带手套进行！
脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤
脱嘌呤液
0.25M HCl
变性液
0.5M NaOH 1.5M NaCl
中和液
0.5M Tris-HCl 1.5M NaCl PH 7.5
标准柠檬酸盐缓冲液 （pH 7.0）
0.3M 柠檬酸三钠 3M NaCl
酶切基因组DNA的凝胶电泳
蒸馏水漂洗凝胶； 4、用中和液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm，之后用蒸馏水漂洗； 5、在20×SSC中平衡凝胶10min，等待转膜。 6、剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿（膜漂浮在液面上），然后在2×SSC中平衡
（膜可以没入溶液中）。滤纸用2×SSC润湿。
重物 吸水纸 尼龙膜
转移液
毛细管转移
用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜 上可以获得最好的结果。
1、探针标记与标记效率的检测
步骤 1 2
3
4
操作 向一个反应管仲中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌 的双蒸水，终体积达16μL。 沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。
紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后 自然晾干后保存，也可以直接进入预杂交步骤。
在2×SSC简单的洗涤一下膜 将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的 要求进行操作。
在2×SSC简单的洗涤一下膜 将尼龙膜放在80℃下真空烘烤2小时
膜的储存：请根据下表选择膜的储存方法。
如果 你想继续实验 如果你想稍后进行实验
3、电泳：先用高电压使样品迁移出胶孔，再改用低电压（1-1.5V/cm）低电压过夜， 至溴酚蓝到达凝胶下部1.5-2cm时停止电泳。
4、凝胶照相，注意紫外照射时间越短越好；然后对凝胶进行修整，切去胶孔和边 缘不含DNA的部分，注意保持边缘齐整，在凝胶正面的右上角切掉一小块以示 方向，之后用记录凝胶的长和宽；凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的 尼龙膜和两张滤纸，在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向，如有需要，用铅 笔在右下角写好编号。
免疫检测
耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋*合适体积的容器用于杂交
地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或 者TE缓冲液
DNA 斑点的脱色 大的托盘 和重新标记探针 水浴
洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
10×SSC；10%SDS；NaOH
Application
DIG-High Prime labeled probes can be used in northern, Southern-, and dot-blot analysis, as well as colony and plaque hybridizations. This kit offers random-primed labeling of DNA templates with DIG-11-dUTP, alkali-labile, and chemiluminescent detection of the DIG-labeled hybrids. This kit was assembled with convenience in mind, offering ready-to-use CSPD supplied with a dripping device for easy application, ready-made blocking solution, and DIG Easy Hyb granules. The DIG-High Prime mixture includes stabilized Klenow enzyme, nucleotides, primers, and reaction buffer, all in one convenient reagent.
那么
立即将这个膜进行预杂交 那么将完全干燥的膜用滤纸或者
保鲜膜包裹后储存于2-8℃
二、探针标记和检测
此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原（steroid hapten）去标记 DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。
附加仪器与所需试剂
操作程序 DIG-DNA标记
水浴
仪器设备
标记效率的半定 带正电荷的尼龙膜* 量
2、预杂交和杂交
步骤 1
2
操作
将适量体积的杂交缓冲液（10ml/100cm2滤膜）提前预热到杂交温度（37-42℃） 。 将点样后的膜放入杂交缓冲液中在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。 注意：膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。 变性地高辛标记的DNA探针（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL）：将新 标记的探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。 注意：因为DIG-11-dUTP是碱标记的，因此DNA探针不能用碱处理（NaOH）的 方法变性。
杂交工作ห้องสมุดไป่ตู้液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
Kit Contents
1. DIG-High Prime, 5x conc., 50 µl （用于探针标记） 2. DIG-labeled Control DNA, 20 µl, (5 µg/ml) pBR328 (linearized with Bam HI)
（用于估测探针产量） 3. DNA Dilution Buffer, 3 x 1 ml （用于估测探针产量） 4. Anti-digoxigenin-AP Conjugate, 50 µl （化学发光检测探针-靶序列杂交） 5. CSPD, ready-to-use, 50 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） 6. Blocking Solution, 10x conc., 4 x 100 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） 7. DIG Easy Hyb Granules, 4 x 100 ml （用于探针与膜的杂交）
Product Description
Sensitivity and specificity: Standard assay uses 1 µg of linearized pBR328. It is usual to expect 0.8 µg labeled DNA after 1 h of labeling, and 2.3 µg labeled DNA after 20 h reaction. In a dot blot hybridization, 0.03 pg of homologous DNA is detectable with chemiluminescence (probe concentrations at 20 ng/ml). A single copy human gene (tPA) is detectable in a Southern blot, loading 1 µg of digested placenta DNA.
盐转：20×SSC为转移液，转移后DNA不能与尼龙膜共价结合，需要紫外交联。 碱转：0.4M NaOH为转移液，转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合。
分子量大于8kb的DNA分子，从凝胶转移到 膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打 断成较小的片段，以方便转移。 紫外线照射打断大分子量DNA 利用脱嘌呤方法打断DNA分子
11.植物基因组DNA的Southern杂 交
主要步骤
1、植物基因组DNA的提取与纯化 2、植物基因组DNA的酶切 3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southern blotting 4、探针序列的获得与标记 5、探针与基因组DNA的杂交 6、杂交信号的检测
一、Southern blotting（变性DNA转移到膜上）
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
琼脂糖凝胶的处理
1、若使用碱转法，可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照 射10-15分钟后用于转膜 。
2、若使用盐转法，则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理。
盐转法脱嘌呤步骤
1、用0.25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色（约15min），50rpm； 2、用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液，漂洗5min； 3、用变性液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm（使DNA变性），之后用
接流至凝胶上方的纸巾层中（液流“短路”现象是导致凝胶中的DNA的转移效 率下降的主要原因）。 5、切一叠（5-8 cm高）与滤纸同等大小的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在上 方放一块玻璃板，玻璃板上压重物，使DNA转移持续过夜（可转移5-8小时）。 6、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联 固定DNA到尼龙膜上。对转移后的凝胶，可在紫外透射仪上观察是否还有残留 的DNA。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
DNA的转移和固定
转移方法和膜注意事项：
1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中 Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不 均匀的问题，EB也可以加入到样品中。
2、所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验。 3、根据我们的经验，用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带
滤纸 凝胶 滤纸桥 支撑架
Southern转膜过程
1、找一块比凝胶大的平台（如大型的制胶板），放入适当的托盘中，加入 20×SSC转移液。
2、平台上铺一层比凝胶稍大的用20×SSC浸透的厚滤纸或2-3层普通滤纸，滤纸两 头接触到托盘中的20×SSC溶液。滤纸和平台之间不能有气泡。 。
3、将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 4、用保鲜膜围绕凝胶周边，但不要覆盖凝胶，以此作为屏障，防止液体自液池直
2、点样，基因组DNA酶切电泳一般用λ/HindIII作为DNA分子量标记。建议干点，即 先加入与凝胶持平的新的电泳缓冲液，使胶孔里没有液体是点样，之后电泳至 样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1-2mm。
有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。 4、碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
带正电荷的尼龙膜
注：所有操作均需带手套进行！
脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤
脱嘌呤液
0.25M HCl
变性液
0.5M NaOH 1.5M NaCl
中和液
0.5M Tris-HCl 1.5M NaCl PH 7.5
标准柠檬酸盐缓冲液 （pH 7.0）
0.3M 柠檬酸三钠 3M NaCl
酶切基因组DNA的凝胶电泳
蒸馏水漂洗凝胶； 4、用中和液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm，之后用蒸馏水漂洗； 5、在20×SSC中平衡凝胶10min，等待转膜。 6、剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿（膜漂浮在液面上），然后在2×SSC中平衡
（膜可以没入溶液中）。滤纸用2×SSC润湿。
重物 吸水纸 尼龙膜
转移液
毛细管转移
用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜 上可以获得最好的结果。
1、探针标记与标记效率的检测
步骤 1 2
3
4
操作 向一个反应管仲中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌 的双蒸水，终体积达16μL。 沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。
紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后 自然晾干后保存，也可以直接进入预杂交步骤。
在2×SSC简单的洗涤一下膜 将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的 要求进行操作。
在2×SSC简单的洗涤一下膜 将尼龙膜放在80℃下真空烘烤2小时
膜的储存：请根据下表选择膜的储存方法。
如果 你想继续实验 如果你想稍后进行实验
3、电泳：先用高电压使样品迁移出胶孔，再改用低电压（1-1.5V/cm）低电压过夜， 至溴酚蓝到达凝胶下部1.5-2cm时停止电泳。
4、凝胶照相，注意紫外照射时间越短越好；然后对凝胶进行修整，切去胶孔和边 缘不含DNA的部分，注意保持边缘齐整，在凝胶正面的右上角切掉一小块以示 方向，之后用记录凝胶的长和宽；凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的 尼龙膜和两张滤纸，在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向，如有需要，用铅 笔在右下角写好编号。
免疫检测
耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋*合适体积的容器用于杂交
地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或 者TE缓冲液
DNA 斑点的脱色 大的托盘 和重新标记探针 水浴
洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
10×SSC；10%SDS；NaOH
Application
DIG-High Prime labeled probes can be used in northern, Southern-, and dot-blot analysis, as well as colony and plaque hybridizations. This kit offers random-primed labeling of DNA templates with DIG-11-dUTP, alkali-labile, and chemiluminescent detection of the DIG-labeled hybrids. This kit was assembled with convenience in mind, offering ready-to-use CSPD supplied with a dripping device for easy application, ready-made blocking solution, and DIG Easy Hyb granules. The DIG-High Prime mixture includes stabilized Klenow enzyme, nucleotides, primers, and reaction buffer, all in one convenient reagent.
那么
立即将这个膜进行预杂交 那么将完全干燥的膜用滤纸或者
保鲜膜包裹后储存于2-8℃
二、探针标记和检测
此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原（steroid hapten）去标记 DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。
附加仪器与所需试剂
操作程序 DIG-DNA标记
水浴
仪器设备
标记效率的半定 带正电荷的尼龙膜* 量
2、预杂交和杂交
步骤 1
2
操作
将适量体积的杂交缓冲液（10ml/100cm2滤膜）提前预热到杂交温度（37-42℃） 。 将点样后的膜放入杂交缓冲液中在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。 注意：膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。 变性地高辛标记的DNA探针（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL）：将新 标记的探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。 注意：因为DIG-11-dUTP是碱标记的，因此DNA探针不能用碱处理（NaOH）的 方法变性。
杂交工作ห้องสมุดไป่ตู้液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
Kit Contents
1. DIG-High Prime, 5x conc., 50 µl （用于探针标记） 2. DIG-labeled Control DNA, 20 µl, (5 µg/ml) pBR328 (linearized with Bam HI)
（用于估测探针产量） 3. DNA Dilution Buffer, 3 x 1 ml （用于估测探针产量） 4. Anti-digoxigenin-AP Conjugate, 50 µl （化学发光检测探针-靶序列杂交） 5. CSPD, ready-to-use, 50 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） 6. Blocking Solution, 10x conc., 4 x 100 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） 7. DIG Easy Hyb Granules, 4 x 100 ml （用于探针与膜的杂交）
Product Description
Sensitivity and specificity: Standard assay uses 1 µg of linearized pBR328. It is usual to expect 0.8 µg labeled DNA after 1 h of labeling, and 2.3 µg labeled DNA after 20 h reaction. In a dot blot hybridization, 0.03 pg of homologous DNA is detectable with chemiluminescence (probe concentrations at 20 ng/ml). A single copy human gene (tPA) is detectable in a Southern blot, loading 1 µg of digested placenta DNA.
盐转：20×SSC为转移液，转移后DNA不能与尼龙膜共价结合，需要紫外交联。 碱转：0.4M NaOH为转移液，转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合。
分子量大于8kb的DNA分子，从凝胶转移到 膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打 断成较小的片段，以方便转移。 紫外线照射打断大分子量DNA 利用脱嘌呤方法打断DNA分子
11.植物基因组DNA的Southern杂 交
主要步骤
1、植物基因组DNA的提取与纯化 2、植物基因组DNA的酶切 3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southern blotting 4、探针序列的获得与标记 5、探针与基因组DNA的杂交 6、杂交信号的检测
一、Southern blotting（变性DNA转移到膜上）
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
琼脂糖凝胶的处理
1、若使用碱转法，可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照 射10-15分钟后用于转膜 。
2、若使用盐转法，则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理。
盐转法脱嘌呤步骤
1、用0.25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色（约15min），50rpm； 2、用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液，漂洗5min； 3、用变性液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm（使DNA变性），之后用
接流至凝胶上方的纸巾层中（液流“短路”现象是导致凝胶中的DNA的转移效 率下降的主要原因）。 5、切一叠（5-8 cm高）与滤纸同等大小的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在上 方放一块玻璃板，玻璃板上压重物，使DNA转移持续过夜（可转移5-8小时）。 6、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联 固定DNA到尼龙膜上。对转移后的凝胶，可在紫外透射仪上观察是否还有残留 的DNA。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
DNA的转移和固定
转移方法和膜注意事项：
1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中 Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不 均匀的问题，EB也可以加入到样品中。
2、所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验。 3、根据我们的经验，用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带
滤纸 凝胶 滤纸桥 支撑架
Southern转膜过程
1、找一块比凝胶大的平台（如大型的制胶板），放入适当的托盘中，加入 20×SSC转移液。
2、平台上铺一层比凝胶稍大的用20×SSC浸透的厚滤纸或2-3层普通滤纸，滤纸两 头接触到托盘中的20×SSC溶液。滤纸和平台之间不能有气泡。 。
3、将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 4、用保鲜膜围绕凝胶周边，但不要覆盖凝胶，以此作为屏障，防止液体自液池直