感受态细胞制备

感受态细胞制备

一、实验目的

1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；

2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；

3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。

二、实验原理

在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。

质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基

因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处

于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收

DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁

的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成

孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子每1μg DNA，甚至1 x 109转化子每1μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

物理制备法：

电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109 ~ 1010转化子/μg闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化率（转化子数／每μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)

理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010

三、实验材料

实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、

实验试剂：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘

油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。

三、实验步骤

（一）化学感受态细胞的制备

（1）菌种的活化：取-70℃的冰箱中感受态细胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB

的平板上进行划线分离。

（2）菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10ml LB液体培养基中，

37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。

（3）菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四个不含有抗生

100mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。

（4）感受态细胞的制备：

①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL

离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。

②弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min。

③弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，

在冰水中静置30min。

④从冰水中取出4℃、3000转每分钟，离心10min，弃去上清液并用移液枪轻轻地

把多余的液体吸干净，加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。

⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml离心管，用剪过的移

液枪头进行分装，每个离心管中分装40μL悬浮液。

⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制

作者和时间的袋中，-70℃保存。

（二）电转化的感受态细胞的制备

第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三步相同。

（4）制备感受态细：

①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到

50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。

②弃去上清液，加入30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀

充分混匀，在4℃、3000转每分钟下离心10min，倒去上清。重复两次；

③再加入30 mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000转每分钟下离心10min，重

复一次。

④弃去上清液，加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast

Extraction、0.25% Trypton)，放置在冰上。

（5）准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管40μl，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。（三）效价检测

1、化学转化：

（1）取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。

（2）在含有40μl感受态细胞的0.5ml离心管中加入1µL稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。

（3）将离心管置于42℃干式恒温器上90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却2～3min。

（4）向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400µL，再转移到10ml离心管中，37℃恒温振荡培养45～60min。

（5）将离心管内容物混匀，分别吸取4.4µL和110µL菌液于含有AMP的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在37℃过夜培养，然后通过菌落数计算效价。

2、电转化: