感受态细胞制备
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义:细胞能够从周围环境中摄取DNA分子,并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用:如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性,以便外源基因进入宿主细胞,实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大,方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞,完成实验。
常用制备方法:细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四.操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml );2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行;3.经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);4. 化合物及无机离子的影响:在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000 倍);5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;6. 质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA;7. 一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比;4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存,时间长了细胞内部液化度较高的情况下,细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤,甚至死亡。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义:细胞能够从周围环境中摄取DNA分子,并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。
作用:如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性,以便外源基因进入宿主细胞,实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大,方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞,完成实验。
常用制备方法:细菌感受态少量制备法(CaCl2法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一.菌液OD值偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四.操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml );2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行;3.经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);4.化合物及无机离子的影响:在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如 Mn2+或 Co2+)、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高( 100-1000 倍);5.所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;6.质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ;7.一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比;4.为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存,时间长了细胞内部液化度较高的情况下,细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤,甚至死亡。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理是通过采用特定的培养条件和处理方法,使细胞转变为感受态细胞。
感受态细胞与其它类型的细胞相比,具有更特殊的功能和形态。
首先,制备感受态细胞通常需要选择合适的细胞系或细胞株作为起始材料。
这些细胞通常具有一定的可塑性和多能性,可以通过适当的诱导和处理转变为感受态细胞。
其次,制备感受态细胞需要提供一系列的培养条件,以满足细胞生长和分化的需要。
这包括提供适当的培养基组成、生长因子、细胞外基质支持等。
适当的培养条件可以促进细胞内信号传导途径的激活,从而触发感受态细胞的形成。
另外,制备感受态细胞的过程中还需要使用一些特定的诱导因子或化合物。
这些诱导因子可以通过激活或抑制特定的信号通路,调节细胞的基因表达和功能,从而诱导细胞转变为感受态细胞。
最后,制备感受态细胞还需要进行一系列的分析和鉴定,以确定细胞是否成功转化为目标细胞。
这包括检测特定标志物的表达、观察细胞形态学的改变、进行功能性实验等。
总之,制备感受态细胞的原理是通过选择合适的起始材料、提供适宜的培养条件、使用特定的诱导因子以及进行分析鉴定等步骤,将细胞转变为目标的感受态细胞。
这个过程涉及到多个层面的调控和影响,需要综合考虑细胞的内外环境因素。
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术,用于将外源 DNA 导入细胞中,并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种,其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞,使细胞膜通透性增加,从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下:1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中,并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中,并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中,并离心沉淀。
4) 去除上清液,将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中,并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4,直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法,该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下:1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中,并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中,并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中,并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中,并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4,直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中,需要注意以下几点:1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂,需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时,需要选择适当的抗生素,以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时,需要选择适当的电场强度和处理时间,以避免细胞损伤。
4) 制备完成后,需要对感受态细胞进行鉴定,以确保其能够表达外源 DNA。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞,听起来像是个高大上的名词,其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下,像个随时待命的服务员,时刻准备接待客人。
细胞的这种状态,通常是在特定的环境下,通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢?这可是生物实验中的关键一步!它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究,甚至是药物开发。
就像一个关键的道具,缺了它,很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂,简单来说就是要让细胞放松心情,准备好接受外来的DNA。
首先,我们需要把细胞放在一个低温环境下,这就像给它们一个凉爽的SPA,让它们变得“懒洋洋”的。
接着,添加一些化学试剂,比如氯化钙,这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA,哇,真是神奇!2.2 处理时间然后,细胞要在这个特殊的环境中待一段时间,让它们完全“感受”这个过程。
通常,我们会让它们静置一小时左右,这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍,兴奋而又期待。
当时间到了,嘿!细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域,感受态细胞的应用真是无处不在。
比如,科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中,看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力,结果往往出乎意料,有时候能发现新的疾病机制,有时候能找到新的治疗方法,简直就是科研的“黑科技”!3.2 工业应用当然,感受态细胞的应用不仅限于实验室,它们在工业上也大显身手。
比如,利用这些细胞生产蛋白质,甚至是药物,提升生产效率,降低成本,简直是企业的“秘密武器”。
有了它,企业就能在竞争中抢占先机,像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之,感受态细胞的制备虽然听起来复杂,但只要掌握了窍门,便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础,更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲,细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术,可应用于许多研究领域,如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说,将培养细胞转化为感受态细胞,可以有三种方法:
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法,大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞,并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染,感受态细胞就会形成。
此外,通过诱变基因表达等方式,也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子,从而影响其功能,抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法,它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外,这些技术还可用于识别及检测特定感受源,并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外,它们还可用于发现新型抗病毒剂,以提高植物抗病能力。
因此,感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义,值得继续探索。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后,能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响,如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率,需要优化这些因素,并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中,过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质,如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定,不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复,避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选,选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单,不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低,且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌,使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高,适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂,操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮,然后在42℃下热 激处理,使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期, 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
感受态细胞制备
感受态细胞制备
感受态细胞制备是一种技术,用于制备仅有一种特定细胞类型的
细胞株。
常用于生物医学研究中,其中包括肿瘤学、免疫学研究等等。
细胞的感受态是指把转录因子的活性形式改变,使其响应环境刺激,
以调节其生化活性或特性。
感受态细胞制备的基本步骤是,首先收集需要制备的细胞株。
此外,设计环境因子,使细胞可以被富集于细胞培养液中,比如添加一
定量的表观遗传因子。
然后,将细胞培养液中的收集细胞用多种组合
方法,如离心法、细胞膜滤过法提纯细胞,最终得到所需的细胞株。
最后,移植所筛选出来的细胞株到环境中,使其进入感受态。
模
拟能够调节受体活性的外界刺激,对其进行诱导,使其进化到更加完
美的感受态细胞。
当准备好后,可以用于临床诊断、研究以及各种免
疫应答的研究等。
无论是医学上的准备,还是科学研究的准备,感受态细胞的制备
都是非常重要的。
人们可以通过改变细胞生长环境,调节外源基因活性,来改变细胞表达,以及形态和功能等,从而有效地控制细胞的生
长和发育。
感受态实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解感受态细胞的制备方法。
2. 掌握感受态实验的基本原理和操作步骤。
3. 学习感受态细胞在基因工程中的应用。
二、实验原理感受态细胞是指对DNA分子具有高亲和力和吸收能力的细胞。
在基因工程中,利用感受态细胞将外源DNA分子导入细胞内,是构建基因表达载体、基因克隆等实验的重要步骤。
感受态细胞的制备方法有化学法和电击法等。
三、实验材料1. 细菌:大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株。
2. 质粒:pUC19载体。
3. 试剂:CaCl2、琼脂糖、DNA分子、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
4. 仪器:电热恒温培养箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、移液器、无菌操作台等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备(1)将大肠杆菌DH5α菌株在LB液体培养基中培养过夜。
(2)次日,将过夜培养的细菌按照1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中,在37℃恒温培养箱中培养2小时。
(3)将培养好的细菌在冰浴中冷却5分钟。
(4)向冷却后的细菌中加入1ml的CaCl2溶液,混匀。
(5)将混匀后的细菌在冰浴中继续冷却30分钟。
2. 感受态实验(1)将质粒pUC19在限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切,回收酶切片段。
(2)将回收的酶切片段与T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。
(3)将连接好的DNA分子转化感受态细胞。
(4)将转化后的细胞在37℃恒温培养箱中培养1小时。
(5)将培养好的细胞涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上,37℃恒温培养箱中培养过夜。
(6)观察菌落生长情况,挑取白色菌落进行PCR验证。
五、实验结果与分析1. 感受态细胞制备成功,细菌在LB琼脂糖平板上生长良好。
2. 转化后的细胞在氨苄西林平板上生长出白色菌落,说明转化成功。
3. PCR验证结果显示,白色菌落中含有目的基因,验证转化成功。
六、实验讨论1. 感受态细胞的制备过程中,冰浴和CaCl2溶液的使用是关键步骤,有助于提高转化效率。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀,立即放在冰上30min; 3、42℃水浴90s,然后迅速冰浴1-2min; 4、加入0.8ml LB液体培养基,160r/min,37 ℃培养
40min; 5、稀释后,取培养液100ul,涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久,新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施;后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求,因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理: 细菌处于低温(0℃)和低渗旳CaCl2溶液
中,菌体膨胀,细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化,转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面,在42℃ 进行短时间旳热激处理,增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度:用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比,但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下,DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5%。
实验原理
CaCl2 法简便易行,用 CaCl2法制备旳 感受态细胞,可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中,每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时,加入 占总体积15%旳无菌甘油于-70℃,能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
感受态细胞制备的方法
感受态细胞制备的方法
感受态细胞的制备方法有多种,其中一种常用的方法是通过转染的方式将特定的基因(例如感受器基因)导入目标细胞中,从而使得这些细胞能够表达特定的感受器或相关蛋白。
这种方法可以使用病毒载体、质粒转染等多种技术实现。
感受态细胞的制备主要有以下步骤:
1. 获取目标细胞:从人体组织或动物模型中获取需要制备感受态细胞的细胞。
2. 选择合适的载体:根据研究需要选择适合的载体,如病毒载体或质粒。
3. 构建转染载体:将目标基因插入到载体中,构建转染载体。
4. 转染目标细胞:将转染载体导入目标细胞中,使其表达特定的感受器或相关蛋白。
5. 筛选稳定表达细胞:通过特定的筛选方法,筛选出稳定表达目标基因的细胞。
6. 验证感受态细胞的功能:通过功能实验等方法验证感受态细胞的功能。
感受态细胞制备的方法可以提供研究人员一个有效的工具,用于研究特定感受器或相关蛋白在生物体内的功能和调控机制。
这些细胞可以用于药物筛选、疾病研究和基因治疗等领域,有助于深入了解感受机制,并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和途径。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备一、准备工作所有试剂、容器均需提早预冷。
1、实验器械4℃离心机(50ml离心管),37℃恒温箱,37℃摇床,超净台(使用前需要紫外消毒15min 至少);0.22μm的滤器2个(过滤灭菌TfB2种溶液),10ml注射器2个;冰盒;高压灭菌的1.5mlEP管1盒,与离心机配套的50ml离心管6个(高压灭菌),高压灭菌的500ml 锥形瓶2个,高压灭菌的100ml玻璃瓶2个,高压灭菌的1ml枪头与200μl枪头各一盒。
2、试剂配制(甘油特别难吸,用蓝枪头慢慢吸吧)① LB平板:单纯LB平板,加有amp或者有kana的(制板时需标注好类型,时间)。
② SOB培养基(Super Optimal Broth)③ TfBⅠ:(100ml制备量)分别称取乙酸钾0.294g,MnCl2 0.99g,KCl 0.146g,CaCl20.111g,置于200ml烧杯中,加入15ml甘油与85mlDDW,摇晃,使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中,4℃储存,使用前务必预冷。
(装在50ml离心管,封口4度储存)④ TfBⅡ(20ml制备量,每次现用现配,装在50ml离心管):分别称取MOPS 0.046g,CaCl20.167g,KCl 0.015g,置于50ml烧杯中,加入3ml甘油与17mlDDW, 摇晃,使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,使用前务必预冷。
配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
(50ml离心管分装)在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后,定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
(50ml离心管分装)在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后,定容至100 ml,高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液,加入到烧杯中。
感受态细胞制备原理
感受态细胞制备原理
感受态细胞(Acceptablecell)又称转基因细胞、外源DNA转化细胞,是指外源基因与宿主基因组结合并在宿主细胞内稳定表达的细胞。
根据其来源的不同,可分为外源基因在大肠杆菌中表达的感受态细胞和质粒在酵母中表达的感受态细胞。
外源DNA进入细胞后,首先与细胞核内的DNA聚合酶结合,使DNA聚合酶分子分解成单链,然后由DNA聚合酶催化单链复制形成双链DNA分子。
在这一过程中,DNA聚合酶活性与病毒颗粒的基因片段大小相关。
当感受态细胞将外源DNA 导入到受体细胞后,它们与受体细胞内的DNA聚合酶和DNA 聚合酶复合体结合,从而使载体上的目的基因片段得以复制和表达。
当质粒上的目的基因被整合到受体细胞基因组中时,目的基因被激活。
当感受态细胞与受体细胞融合后,被激活的目的基因便会在受体细胞中以单拷贝形式表达出来。
因此,感受态细胞对目的基因有较强的选择压力,在表达过程中会筛选出最具表达潜力的部分。
—— 1 —1 —。
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切, 使其具有黏性末端,便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化,去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理,使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集,涂布在含 有抗生素的选择性培养基上,筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性,使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合,通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内,并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种,以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2,使细菌细胞壁产生可逆性损伤,提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中,使细胞壁进一步损伤,提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA,通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一,因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞,细胞形态无明显变化,生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后,成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织,使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法:
1. 免疫刺激法:免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内,刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后,从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞,并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下,这些细胞会分化为感受态细胞,表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法:细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号,诱导细胞发生转变,从而获得感受态细胞。
例如,通过改变细胞培养基的成分和配比,或添加特定的生长因子和信号分子,可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时,需要注意实验条件的细节,确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外,在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定,确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态细胞制备流程
感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程,这是一个非常复杂和精确的过程,涉及到许多实验室技术和设备。
感受态细胞是指在特定的刺激下,可以触发细胞产生反应的细胞状态。
感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程,如细胞信号传导、疾病机制等。
下面是一个常见的感受态细胞制备的流程:1.细胞培养首先,需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。
细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。
培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。
然后,将细胞接种到培养器皿中,并在恒定的温度和湿度下进行培养。
2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量,可以开始进行细胞处理。
这可以包括刺激细胞,例如添加化学物质、压力或温度变化。
刺激过程需要精确控制,以确保得到一致的结果。
3.细胞取样在细胞处理后,需要进行细胞取样。
这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。
取样过程需要快速和准确,以确保细胞状态的准确性。
4.细胞固定取样后,细胞需要固定以保持其形态和结构。
常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。
细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子,以便后续的染色或分析。
5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。
染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。
这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上,或使用转染技术将其引入细胞内。
6.显微镜观察完成染色和标记后,可以使用显微镜来观察细胞。
显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息,并且可以检测到染色或标记物的荧光。
这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。
7.数据分析和解读最后,需要对得到的数据进行分析和解读。
这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。
数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息,并为后续的研究和应用做出贡献。
感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。
任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。
因此,研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态,可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法:
1. 培养细胞:选择需要研究的感受态细胞类型,如神经元、免疫细胞等,在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理:给予细胞一定的外界刺激,如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞:在刺激处理后,收集细胞,可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质:利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质,用于后续分析。
5. 分析感受态:通过各种分析方法,如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等,检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异,因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
(写作参考:)。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10mllb液体培养基的50ml离心管中。
(同时做培养基和枪头的空白对照)2.37℃,220rpm,培养14-16小时。
3.第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000mllb液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次od,当od值达到0.3-0.4时,停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。
离心5分钟后,向杯中加入少量H2O,然后以4000转/分的转速悬浮。
6.弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min。
7.弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油,4℃,4000rpm,离心10min。
8.丢弃上清液,向每个离心杯中加入5毫升10%甘油,以暂停沉淀,然后将细菌溶液分装在1.5毫升离心管中,每管300微升,并储存在-80℃的冰箱中。
同时取100μL主管态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化检测转化效率。
9.次日观察转化子生长情况,并记录。
二、连接产物纯化1.将连接产品转移至1.5毫米彭多夫管中,并添加以下试剂:10μlofddh2o2μlof3mnaac(ph5.2)50μl无水乙醇轻轻混匀,稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上;2.4℃,topspeed离心30分钟;3.小心清除上清液,避免接触管道底部的沉淀物;4.加入500μl70%的乙醇,轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注:不要离心混匀);5.4℃,topspeed离心5分钟;6.小心地去除上清液,并将Eppendorf管置于空气中,直到没有乙醇气味;7.将10μLddh2o重新溶解和沉淀,并在4℃下短期储存,在-20℃下长期储存;3、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;2.取1μL纯化质粒置于1.5ml离心管中,用0.1cm电极杯冰上预冷。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
感受态细胞制备
一、实验目的
1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术;
2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法;
3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。
二、实验原理
在基因克隆技术中,所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞,表达相应的选择标记基因,并在一定的培养条件下,在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内,才能进行扩增和表达,从而获得大量的克隆基
因。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态,而另一些细菌只有处于某个生长时期时,才会处
于感受态,如大肠杆菌。
大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收
DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁
的通透性增强,目前还可以使用电激的方法,通过瞬间的高压电流,在细胞上形成
孔洞,使外源DNA进入胞内,从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级,达到1 x 108转化子每1μg DNA,甚至1 x 109转化子每1μg DNA,所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选
化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。
物理制备法:
电转法,除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109 ~ 1010转化子/μg闭环DNA。
因操作简便,愈来愈为人们所接受。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
转化总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化率(转化子数/每μg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(μg)
理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010
三、实验材料
实验仪器:恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、
实验试剂:0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘
油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。
三、实验步骤
(一)化学感受态细胞的制备
(1)菌种的活化:取-70℃的冰箱中感受态细胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB
的平板上进行划线分离。
(2)菌种的前培养:从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10ml LB液体培养基中,
37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
(3)菌种的准备:将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四个不含有抗生
100mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。
(4)感受态细胞的制备:
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。
把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL
离心管中,在4℃、3000转每分钟,离心10min。
②弃去上清液,加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液,轻轻混匀,在冰水中静置30min。
③弃去上清液,加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液,用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀,
在冰水中静置30min。
④从冰水中取出4℃、3000转每分钟,离心10min,弃去上清液并用移液枪轻轻地
把多余的液体吸干净,加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaCl2溶液。
用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。
⑤把液氮倒到小的塑料盒子里,在离心管架子上摆放好0.5ml离心管,用剪过的移
液枪头进行分装,每个离心管中分装40μL悬浮液。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中,使之迅速冷冻,然后放到标有感受态细胞种类、制
作者和时间的袋中,-70℃保存。
(二)电转化的感受态细胞的制备
第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三步相同。
(4)制备感受态细:
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。
把100 mL培养液均匀分成两份到
50 mL离心管中,在4℃、3000转每分钟,离心10min。
②弃去上清液,加入30 mL 三蒸水,用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀
充分混匀,在4℃、3000转每分钟下离心10min,倒去上清。
重复两次;
③再加入30 mL含10%甘油水溶液,在4℃、3000转每分钟下离心10min,重
复一次。
④弃去上清液,加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast
Extraction、0.25% Trypton),放置在冰上。
(5)准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL离心管若干放到离心管架子上,将悬浮的感受态细胞分装在离心管中,每管40μl,迅速盖好盖子放入到液氮中,使之迅速冷冻,然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中,-70℃保存。
(三)效价检测
1、化学转化:
(1)取化学转化感受态细胞于冰上解冻,同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。
(2)在含有40μl感受态细胞的0.5ml离心管中加入1µL稀释后的标准质粒充分混匀。
冰上静置30min。
(3)将离心管置于42℃干式恒温器上90s,然后迅速放回冰上,使细胞冷却2~3min。
(4)向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400µL,再转移到10ml离心管中,37℃恒温振荡培养45~60min。
(5)将离心管内容物混匀,分别吸取4.4µL和110µL菌液于含有AMP的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开,将平板置于室温下直到液体被吸收,倒置平板,在37℃过夜培养,然后通过菌落数计算效价。
2、电转化:
(1)取电转化感受态细胞于冰上解冻,,标准质粒也置于冰上,同时准备干净的电击杯于冰上预冷。
(2)在含有40μl感受态细胞的0.5ml离心管中加入1µL稀释十倍的标准质粒,充分混匀。
然后转移到电击杯中,把电击杯放在电击仪上进行电击(2500V,5ms)。
(3)在电击杯中加入160µL无菌LB培养液(无抗生素),然后充分混匀,吸取于10ml离心管中,置于37℃恒温振荡器中培养45~60min.
(4)分别取2µL和50µL涂板,涂板操作同化学转化。
(5)平板放到37℃的恒温培养箱过夜培养。
第二天早上读取两个平板的菌落数。
四、实验结果
1、电转化感受态细胞的效价:涂2µL菌液的平板上菌落数为88个,通过计算
知道,电转化感受态细胞的效价为8.8×108。
2、化学转化感受态细胞的效价:无菌落生成,同组的也没有出来结果。
五、讨论
1、感受态细胞制备及转化中的影响因素
①细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或
-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。
密度过高或不足均会影响转化效率。
②质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就
会降低。
1ng的标准质粒即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
③试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
④防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
⑤整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
2、效价检测结果分析:
化学转化感受态细胞效价检测结果没有转化成功,而且所有人的结果都没有转化结果,所以造成该结果的可能原因是制备感受态细胞所使用的试剂配制有误。
电化学转化的结果有菌长出,在涂2μl的菌液的平板上有80个菌落。
标准质粒的浓度为0.1ng/μl。
使用时稀释十倍。
所以2μl的菌液中有0.1pg的标准质粒。
那么转化率
=80/0.1*10-6=8*108。