清华大学Elisa实验报告

Elisa实验报告

实验名称：

酶联免疫吸附剂测定

实验原理：

酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。

实验材料与试剂：

1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。

2．酶联免疫检测仪。

3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。

4．包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）：

Na2CO3 0.15g,

NaHCO3 0.293g，

蒸馏水稀释至100 ml。

5．稀释液（PBS-Tween）：

NaCl 8g,

KCl 0.2g，

KH2PO4 0.2g,

Na2HPO4·12H2O 2.9g,

Tween-20，0.5ml，

蒸馏水加至1000ml。

6．洗涤液：同稀释液。

7．封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。

8．邻苯二胺溶液(底物)：

配制：

0.1 mol/L 柠檬酸(2.1g/100ml), 取6.1ml，

0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163g/100ml),取6.4ml,

加蒸馏水12.5ml,

取邻苯二胺8mg（溶解）；

临用前加30 % （体积分数）H2O2 40μl。

9．终止液：2 mol/L H2SO4。

实验步骤：

１．包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃温育30min。

２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

３．加封闭液200μl，37 ℃温育30min。

４．洗涤同2。

５．加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。同时作稀释液对照。37 ℃温育30min。

６．洗涤同2。

７．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 37 ℃温育30min。

８．洗涤同2。

９．加底物：邻苯二胺溶液加200μl，室温暗处5min。

１０．加终止液：每孔50μl。

１１．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。

实验结果

数据如下：

P.S:紫色数据表示异常

实验讨论：

1无一抗（10）数据值存在异常。理论上应趋近于零。可能是由于受污染所致

实验现象比较清晰，随浓度由浓到稀，颜色由深黄渐变为浅黄。

2线性关系比较明显。但斜率随浓度减小而有所增大。这可能是在使用取液器时有气泡混入，导致实际浓度低于理论上的浓度。

3组号（2）（4）（5）中3个样本数据差别较大，可能是因为配血清时混合不够均匀所致。

这个实验采用了间接法测定，利用酶的催化放大作用提高了检测的灵敏度。作为一名精仪系的学生，这给予我的启示就是，在直接测量精度如果遇到瓶颈时，没有合适的方法提高精度，那么可以考虑寻找一个“中介”，而这个“中介”应该具有“在变量产生微小变化时能放大这种变化，或者用另一种形式体现这种变化”的特性，从而测量变得可行。而该实验中，最终效果就是我们可以直接通过颜色深浅大致看出浓度的不同。这一点很值得思考。

另外由于操作不熟练、不仔细，也带来了一些粗大误差，如无一抗（10）。这是我们实验中应该避免的。