苯酚降解菌

苯酚降解菌2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析

一．摘要：

环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。在油田地层水中分离出苯酚降解菌BF80，并且从BF80中克隆出编码2，3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通过PCR进行片段克隆，并用UNIQ-10柱形DNA 回收试剂盒回收产物，采用NCBI BLAST序列分析表明该基因片段长1207bp,序列比较分析表明该基因片段与2-苯酚羟化酶A相似度达88%，氨基酸序列分析表明其与2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达96%。本实验研究编码降解苯酚的2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。

Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysis

Abstract:

Phenol pollution in the environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum, chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics still only a small number of micro-organisms, their decomposition.

In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - catechol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis

关键词：苯酚苯酚降解菌基因克隆基因序列分析

二、前言

苯酚俗名石炭酸，无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味（与浆糊的味道相似）。置露空气中或日光下被氧化逐渐变成粉红色至红色，在潮湿空气中，吸湿后，由结晶变成液体。酸性极弱（弱于Ｈ２ＣＯ３），有特臭，有毒，有强腐蚀性。环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，含酚废水是当今世界上危害大、污染范围广的工业废水之一，是环境中水污染的重要来源。在许多工业领域诸如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、木材纤维、化学有机合成工业、朔料、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有酚。这些废水若不经过处理，直接排放、灌溉农田则可污染大气、水、土壤和食品。目前对含酚废水的处理方法主要以下五种，一、吸附法，利用一些多孔吸附剂较高的比表面积表现出的较强的吸附性能将废水中的酚类物质吸附,吸附剂吸附饱和后可再生使用,酚类物质也可以回收利用。常用的吸附剂主要有活性炭、磺化煤、大孔吸附树脂及有机合成吸附剂等。此种方法的最大优点是设备简单、操作方便、净化效率高、吸附量大及吸附选择性高等。活性炭吸附虽然吸附量大,但再生困难,因而其使用逐渐不为人们看好。磺化煤的吸附容量较小，处理后废水中含酚量远达不到排放标准，需进行二级处理。所以活性炭和磺化煤在处理高浓度含酚废水时受到了一定的限制。二、萃取法，萃取法主要是利用难溶于水的萃取剂与废水接触,使废水中的酚类化合物在从水相转移到溶剂相中,从而达到酚类物质与水分离的目的。根据目前回收与处理含酚废水的技术水平和经济核算的结果,对于浓度高于1000ｍｇ/Ｌ的高浓度含酚废水,采取溶液萃取工艺,不失为一种经济高效的处理方法。三、液膜分离技术，液膜分离技术和溶剂萃取过程相似，也是由萃取与反萃取两个过程构成的。但是在液膜分离过程中，萃取与反萃取是同时进行，一步完成的。其传质速率明显提高，甚至可以实现溶质从低浓度向高浓度的传递。四、气提及蒸馏气提法，气提法是根据挥发性酚类化合物与水蒸气形成共沸化合物,四、气提及蒸馏气提法利用酚在两相中的浓度差将酚水分离,从而使水得以净化。高浓度的含酚废水可用气提法处理,去除率在80%～85%。此种方法可回收酚,效率高,操作简单,但对不挥发性酚不能使用。五、生物法，对于高浓度的含酚废水来说，生物法的处理效果不是很好，但是随着生物新技术的发展，近来用生物法处理高浓度含酚废水也有一些报道。应用包埋法固定化微生物技术处理废水是废水处理的新技木。经固定化酶和固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降解有机物能力强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷。在生物法当中，苯酚降解菌扮演着重要角色，目前国内外有关苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析，以及苯酚降解菌的分离鉴定及其苯酚降解特性分析的研究已见诸报道；另外也有对于外界条件对嗜热菌BF80生长及苯酚降解的影响研究，但对参与编码苯酚降解过程的各种酶的基因的研究目前尚少见报道。苯酚降解菌是一种能有效降解苯酚的微生物目前对该类微生物的种类研究尚不清晰，有报道用富集培养和直接涂平板培养的方法,从含酚废水处理系统的悬浮污泥中分别分离了57株和55株苯酚降解菌（参见文献1）。蝙蝠80苯酚降解菌，是苯酚降解菌的一种，有研究表明Ca2+和Mg2+对嗜热菌BF80生长有促进作用，二者对嗜热菌BF80的最大苯酚降解率几乎没有影响，但Ca2+降低其降解速率，而Mg2+