质粒测序引物
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。
本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。
1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。
正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。
引物的主要特点有以下几个方面：（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。
（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。
（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。
基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。
具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。
其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目标序列特异性扩增。
在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。
（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。
一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。
（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。
2. 引物设计流程在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。
（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。
一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。
质粒的反向 pcr
质粒的反向 pcr质粒的反向PCR是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和确定质粒中目的基因的序列。
下面将详细介绍反向PCR的原理及步骤。
反向PCR是一种特殊的PCR方法，它与常规PCR的不同之处在于引物的设计。
在常规PCR中，引物是根据目的基因的已知序列设计的，用于扩增目的基因的片段。
而在反向PCR 中，引物则是根据已知的质粒序列设计的，用于扩增质粒中未知区域的片段。
反向PCR的原理基于以下几个假设：1) 质粒的已知序列和未知区域是相邻的；2) 扩增产物在PCR反应中会扩增未知区域的两侧序列。
反向PCR的步骤如下：1. DNA提取与限制性内切酶切割：首先，从含有目标质粒的菌株中提取质粒DNA。
接下来，用限制性内切酶切割质粒DNA，使未知区域与已知序列分开。
2. 偏移引物的设计：根据已知的质粒序列，设计一对偏移引物。
这对引物分别位于未知区域的两侧，并有适当的长度和碱基组成。
3. 反向PCR扩增：将切割后的质粒DNA作为模板，使用偏移引物进行反向PCR扩增。
PCR反应的条件包括合适的温度和时间参数，以确保目标序列的高效扩增。
4. 凝胶电泳和提取扩增产物：将反向PCR扩增后的产物进行凝胶电泳分离，通过电泳结果可以确定未知区域的大小和存在与否。
然后，从凝胶中提取目标产物，以便进一步分析和测序。
5. 序列分析：用测序方法对扩增产物进行测序，以确定未知区域的序列。
通过反向PCR技术，研究人员可以获取目标质粒中未知区域的序列信息。
这对于研究质粒功能以及质粒在基因克隆和表达中的应用具有重要意义。
总结起来，反向PCR是一种重要的质粒分析技术，通过设计合适的引物和PCR反应条件，可以扩增和测序未知区域的序列。
这种技术在基因克隆、质粒分析和分子生物学研究中具有广泛的应用前景。
CRISPR-Cas9体系实验流程(2)
CRISPR-Cas9体系实验流程(2)二代测序RRBS一、材料试剂准备1）质粒：pSpCa9(BB)(AddgeneplamidID:42230)，若实验用gRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。
pUC19(Invitrogen,cat.no.15364-011)可用于构建gRNA，若用PCR 产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNAcarrier。
上述三种质粒，根据实验选择gRNA的表达方式（PCR产物/单载体系统/双载体系统）来确定具体使用哪种。
2）超纯水，DNae/RNae-free(LifeTechnologie,cat.no.10977-023) 3）高保真聚合酶，KapaHiFi(KapaBioytem),PfuUltra(Agilen)，HerculaeIIfuionpolymerae均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。
4）TaqDNApolymeraewithtandardTaqbuffer(NEB,cat.no.M0273S)用于一般检测。
5）QIAquickgele某tractionkit(Qiagen,cat.no.28704)6）QIApreppinminiprepkit(Qiagen,cat.no.27106)7）FatDigetBbI(BpiI)(Fermenta/ThermoScientific,cat.no.FD1014)，如需要将gRNA构建到pSpCa9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。
8）T7DNAligaewith2某rapidligationbuffer(Enzymatic,cat.no.L602L).或者T4DNAligae，二者无区别。
10）dNTPolutionmi某,25mMeach(Enzymatic,cat.no.N205L)11）MgCl2,25mM(ThermoScientific,cat.no.R0971)12）T4polynucleotidekinae(NewEnglandBioLab,cat.no.M0201S)13）PlamidSafeATP-dependentDNae(Epicentre,cat.no.E3101K)14）Adenoine5′-triphophate,10mM(NewEnglandBioLab,cat.no.P0756S)15）SOCmedium(NewEnglandBioLab,cat.no.B9020S)二、实验流程或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为targetite，一般targetite可选在正义链或者反义链，二者均可。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
质粒载体测序报告
质粒载体测序报告1. 引言质粒载体是一类广泛应用于分子生物学和基因工程研究的工具。
通过质粒载体，研究人员能够将外源基因导入到目标细胞中，实现基因的表达和功能分析。
质粒载体测序报告旨在对质粒载体进行全面的测序分析，以确定其序列信息，并评估其质量和适用性。
2. 实验流程质粒载体测序通常包括以下步骤：1.质粒提取：将质粒提取出来，通常采用离心、酚-氯仿提取或商用提取试剂盒等方法。
2.质粒纯化：通过离心、凝胶电泳等方法，将质粒与其他细胞成分分离。
3.质粒测序文库制备：将质粒线性化并连接适当的测序引物，反应后通过PCR扩增文库。
4.高通量测序：将质粒文库装入Illumina或其他测序平台中进行高通量测序。
5.数据分析：对测序数据进行质量控制、序列拼接和序列注释等分析。
3. 数据质量控制在质粒载体测序过程中，数据质量控制是必不可少的一步。
常见的数据质量控制指标包括测序错误率、Q值分布和序列长度分布等。
通过对质量较低的序列进行滤除或修剪，可以提高后续数据分析的精确性和准确性。
4. 序列拼接与注释在质粒测序后，通常需要对产生的序列进行拼接和注释以获取准确的质粒序列信息。
序列拼接主要通过比对软件如Bowtie、BLAST等将测序reads 结合在一起。
而序列注释则是通过比对测序 reads 到已知的数据库，如GenBank、NCBI等，以获得质粒中的潜在功能元件。
5. 结果和讨论通过对质粒载体测序的实验和数据分析，我们得到了以下结果：1.质粒载体序列：经过拼接和注释，我们获得了质粒载体的完整序列，长度为XXX bp。
2.质量评估：通过数据质量控制，我们对测序数据进行了过滤和修剪，确保了序列的准确性和可靠性。
3.序列注释：通过将测序 reads 比对到已知基因库，我们对质粒中的潜在功能元件进行了注释，包括启动子、终止子、转录因子结合位点等。
4.比对结果：我们将质粒序列与已知质粒库进行了比对，发现该质粒与已知质粒高度相似，符合预期。
一、测序样品要求
一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。
菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。
若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。
3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。
PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。
2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。
3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。
不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。
4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。
5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。
6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。
二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。
各种带标签的质粒
产品简介：产品编号产品名称产品包装产品价格D2632 pCMV-C-Flag1μg 798.00元pCMV-C-Flag是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达C端和Flag tag(Flag标签)融合的目的蛋白的表达质粒。
含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的3'端含有一个可以编码Flag标签的序列，因此可以表达出含有Flag标签的融合蛋白，可以方便地使用抗Flag的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和分离纯化。
质粒为卡那霉素抗性。
转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-C-Flag质粒的主要信息如下：Feature Nucleotide PositionCMV promoter 1–602T3 promoter and T3 primer binding site 620–639multiple cloning site 680-740c-Flag tag 741-764T7 promoter and T7 primer binding site 817–838SV40 polyA signal 850–1233f1 origin of ss-DNA replication 1371–1677bla promoter 1702–1826SV40 promoter 1846–2184neomycin/kanamycin resistance ORF 2219–3010HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 3011–3469pUC origin 3598–4265pCMV-C-Flag质粒的图谱如下：pCMV-C-Flag的多克隆位点的详细图谱如下：XmaI PstISacI Small BamHI HindIII651 GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGC CCGGGCGGAT CCAAGCTTCTCTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGAGATCG GGCCCGCCTA GGTTCGAAGAFlagEcoRI EcoRV SacI BglII XhoI XbaI D Y K D701 GCAGGAATTC GATATCGTCG ACAGATCTCT CGAGTCTAGA GATTACAAGGCGTCCTTAAG CTATAGCAGC TGTCTAGAGA GCTCAGATCT CTAATGTTCCtagD D D K ApaI751 ATGACGACGA TAAGTAAGGG CCCGGTACCT TAATTAATTA AGGTACCAGGTACTGCTGCT ATTCATTCCC GGGCCATGGA ATTAATTAAT TCCATGGTCCpCMV-C-Flag中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-C-Flag)包括： Afl II Age I Ahd I Asc I Bbs I Bbv II Blp IBsg I BsiW I BsmB I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 IBstE II Ear I Eco47 III Eco72 I EcoN I Esp I Fse INru I PflM I Pme I Pml I PpuM I Psp1406 I Sap ISca I Spe IpCMV-C-Flag中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-C-Flag once)包括：Nde I CA`TA,TG 241 SnaB I TAC|GTA 347Nhe I G`CTAG,C 598Sac I G,AGCT`C 656Sac II CC,GC`GG 663 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 664 Not I GC`GGCC,GC 669 PspA I C`CCGG,G 681 Xma I C`CCGG,G 681Srf I GCCC|GGGC 683 Sma I CCC|GGG 683 BamH I G`GATC,C 688 Hind III A`AGCT,T 694Pst I C,TGCA`G 704 EcoR I G`AATT,C 706 EcoR V GAT|ATC 714Sal I G`TCGA,C 718Acc I GT`MK,AC 719Bgl II A`GATC,T 724 PaeR7 I C`TCGA,G 730 Xho I C`TCGA,G 730Xba I T`CTAG,A 736Bsp120 I G`GGCC,C 769 Apa I G,GGCC`C 773 Pvu I CG,AT`CG 851Bcl I T`GATC,A 1005Mun I C`AATT,G 1098Hpa I GTT|AAC 1111Mlu I A`CGCG,T 1234Dra III CAC,NNN`GTG 1464Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 2123 BseR I GAGGAG 16/14 2166Stu I AGG|CCT 2169Cla I AT`CG,AT 2188Kas I G`GCGC,C 2347Nar I GG`CG,CC 2348Ehe I GGC|GCC 2349Bbe I G,GCGC`C 2351Msc I TGG|CCA 2430Tth111 I GACN`N,NGTC 2466 BsrD I GCAATG, 8 2581Bsp1286 I G,DGCH`C 2651Rsr II CG`GWC,CG 2864BsiC I TT`CG,AA 3030BstB I TT`CG,AA 3030Bsa I GGTCTC 7/11 3337HgiE II ACCNNNNNNGGT-1/13 3677 ApaL I G`TGCA,C 3952pCMV-C-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：T3 primer(620–639): 5′AATTAACCCTCACTAAAGGG 3′ T7 primer(817-838): 5′GTAATACGACTCACTATAGGGC 3′pCMV-C-Flag的全序列信息：D2632 pCMV-C-Flag-seq.txt产品简介：产品编号产品名称产品包装产品价格D2672 pCMV-C-Myc1μg 798.00元pCMV-C-Myc是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达C端和Myc tag(Myc标签)融合的目的蛋白的表达质粒。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计
质粒测序是一种常用的分子生物学技术，用于分析质粒的基因组成和结构。
在质粒测序过程中，引物是至关重要的组成部分，其质量和设计直接影响到测序数据的准确性和可靠性。
因此，正确设计合适的引物至关重要。
设计引物的首要步骤是选择目标序列。
质粒测序通常需要分析全长或部分序列，因此需要确定目标序列的起止位置。
在选择目标序列时，还需要考虑序列的特点，如长度、GC含量和反向互补性等。
这些因素将影响引物的长度和特异性。
设计引物时，需要遵循一些基本原则。
首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以保证特异性和特异性。
其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物与目标序列的结合。
此外，还需要确保引物的特异性，以避免与其他序列的杂交信号。
引物设计时还需要考虑引物间的距离和方向。
引物之间的距离应该足够远，以避免重叠或杂交。
另外，正向和反向引物之间的距离应该相等，以确保扩增产物的长度均匀。
总之，正确设计引物对质粒测序的结果至关重要。
根据目标序列的特点，采用合适的引物设计策略和软件，可以设计出高质量的引物，从而获得更加准确和可靠的测序数据。
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pMal-c2x质粒图谱及多克隆位点分析
pMalc2x载体基本信息出品公司: NEB载体名称: pMal-c2X, pMalc2X, pMal c2X质粒类型: 大肠杆菌(Escherichia coli)蛋白表达载体表达水平: 高启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6646 bp5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'-GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-3'; MBP-F: 5'-gatgaagccctgaaagacgcgcag-3'3' 测序引物及序列: pBad-R: 5'-gatttaatctgtatcagg-3';M13-F: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'载体标签: N-MBP, N-Factor Xa载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。
产品目录号: E8000S稳定性: 瞬时表达Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息pMalc2x载体简介pMalc2x载体序列LOCUS pMAL-c2X 6646 bp DNA circular SYN DEFINITION pMAL-c2XACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors.COMMENT This file is created by Vector NTI/COMMENT VNTAUTHORNAME||FEATURES Location/Qualifierssource 1..6646/organism="pMAL-c2X"/mol_type="other DNA"misc_feature 72..1163/label="lacI"CDS 204..1163/label="ORF frame 3"promoter 1407..1435/label="tac_promoter"misc_feature 1447..1469/label="M13_pUC_rev_primer"CDS 1528..2916/label="ORF frame 1"misc_feature 2602..2625/label="MBP_F_primer"promoter complement(2736..2752)/label="M13_forward20_primer"misc_feature complement(2745..2767)/label="M13_pUC_fwd_primer"misc_feature 2745..2888/label="lacZ_a"misc_feature complement(2931..2948)/label="pBAD_rev_primer"misc_feature complement(2931..2948)/label="pTrcHis_rev_primer"terminator 2981..3138/label="rrnB_terminator"terminator 3104..3147/label="rrnB_T1_terminator"terminator 3279..3306/label="rrnB_T2_terminator"promoter 3348..3376/label="AmpR_promoter"gene 3418..4278/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 3418..4278/label="ORF frame 1"rep_origin complement(4510..4816)/label="f1_origin"rep_origin 4928..5547/label="pBR322_origin"misc_feature 5946..5968/label="pGEX_3_primer"misc_feature complement(5962..6153)/label="ROP"ORIGIN1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA1021 AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA1081 CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT1141 CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TAAGTTAGCT CACTCATTAG1201 GCACAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGACTGCACG GTGCACCAAT GCTTCTGGCG1261 TCAGGCAGCC ATCGGAAGCT GTGGTATGGC TGTGCAGGTC GTAAATCACT GCATAATTCG1321 TGTCGCTCAA GGCGCACTCC CGTTCTGGAT AATGTTTTTT GCGCCGACAT CATAACGGTT1381 CTGGCAAATA TTCTGAAATG AGCTGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA1441 ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCCAGT CCGTTTAGGT GTTTTCACGA1501 GCACTTCACC AACAAGGACC ATAGCATATG AAAATCGAAG AAGGTAAACT GGTAATCTGG1561 ATTAACGGCG ATAAAGGCTA TAACGGTCTC GCTGAAGTCG GTAAGAAATT CGAGAAAGAT1621 ACCGGAATTA AAGTCACCGT TGAGCATCCG GATAAACTGG AAGAGAAATT CCCACAGGTT1681 GCGGCAACTG GCGATGGCCC TGACATTATC TTCTGGGCAC ACGACCGCTT TGGTGGCTAC1741 GCTCAATCTG GCCTGTTGGC TGAAATCACC CCGGACAAAG CGTTCCAGGA CAAGCTGTAT1801 CCGTTTACCT GGGATGCCGT ACGTTACAAC GGCAAGCTGA TTGCTTACCC GATCGCTGTT1861 GAAGCGTTAT CGCTGATTTA TAACAAAGAT CTGCTGCCGA ACCCGCCAAA AACCTGGGAA1921 GAGATCCCGG CGCTGGATAA AGAACTGAAA GCGAAAGGTA AGAGCGCGCT GATGTTCAAC1981 CTGCAAGAAC CGTACTTCAC CTGGCCGCTG ATTGCTGCTG ACGGGGGTTA TGCGTTCAAG2041 TATGAAAACG GCAAGTACGA CATTAAAGAC GTGGGCGTGG ATAACGCTGG CGCGAAAGCG2101 GGTCTGACCT TCCTGGTTGA CCTGATTAAA AACAAACACA TGAATGCAGA CACCGATTAC2161 TCCATCGCAG AAGCTGCCTT TAATAAAGGC GAAACAGCGA TGACCATCAA CGGCCCGTGG2221 GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT 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GTTCGCTCGC GTATCGGTGA6541 TTCATTCTGC TAACCAGTAA GGCAACCCCG CCAGCCTAGC CGGGTCCTCA ACGACAGGAG6601 CACGATCATG CGCACCCGTG GCCAGGACCC AACGCTGCCC GAAATT //>gi|19573717|emb|AX377531.1| Sequence 8 from Patent WO0212553 CCGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCA GGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCG TTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGG CGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCG TTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATC AACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGC ACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTG CTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGC AAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAAT ATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTC 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TCAGAATTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGT GACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGT AATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCAGCTT GGCTGTTTTGGCGGATGAGATAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTG ATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTG AAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAAT AAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGG ACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTT TCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCC TGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATT CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT GAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTCTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCC CGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC TCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACC ATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTT TTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCA AACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTT CTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGT CAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTACCCCGGTTGATAATCAGAAAAGCCCCA AAAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATATTTAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAA ATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAG AATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACT CCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAA 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ATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACC GCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGG TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT CTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCG ACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGC TGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCT GCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGCAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTC GTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTC CTGTTTGGTCACTTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGAATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAA CGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGT AAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTT AATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTG CAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCT CAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAA CCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGC。
质粒测序操作流程_简化
质粒测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备：（一）实验试剂：标准质粒，测序引物，Bigdye v3.1, ddH2O，POP7胶，Sequence Standard（3130），10 x Buffer，HiDi（二）实验耗材：96孔板，0.2EP管，移液枪，Centri-SEP纯化柱，计时器，记号笔二、实验操作具体步骤：（一）质粒测序反应体系（标准）：质粒（0.2ug/ul） 1 ul引物(0.8→3.2 pmol/ul) 4 ulBigDye(2.5x) 8 ulddH2O 7 ul总体积20 ul测序PCR循环条件:96 ℃1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃5 sec →60 ℃4 min) x 25循环→4℃保温（二）测序产物纯化（Centri-SEP柱纯化）：1．水化离心柱（已提前制备好）2．去除间质液体2.1 打开离心柱的顶盖，然后去掉底部尾塞。
2.3 让离心柱中过量的液体在洗脱管（2ml EP管）中控干，弃去液体。
2.4 将离心柱和洗脱管一起离心（转速750g，2mins）去除间质中的液体。
2.5 大约能去除300ul液体。
如果离心柱底部有液滴，用纸吸干，弃去洗脱管和间质液体。
不要使凝胶过分干燥，即刻开始样品处理。
3．样品处理3.1 将离心柱置于光线充足地方。
将20ul测序产物混合液直接转移至凝胶顶端的正上方中心位置，注意不能碰到凝胶。
3.2 将离心柱放入样品收集管（1.5ml EP管），并置于离心机转子中。
保持原先的离心柱方向，将离心柱和样品收集管同时离心（转速750g，2mins）。
纯化的样品将被收集在样品收集管底部，弃去离心柱3.3 真空离心使样品干燥，不要使用加热法。
（三）测序标准品准备1．取一管低压冻干的Sequencing Standard，加入170ul Hi-Di重悬，混匀离心2. 取10ul至96孔板中（四）样品变性5ul纯化样品+ 5ul HiDi，混匀，至96孔板中，95℃2min变性，迅速放置于冰上，准备上机。
测序样品要求
一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。
菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。
若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。
3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。
PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。
2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。
3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。
不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。
4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。
5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。
6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。
二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。
测序常见问题分析
测序常见问题分析1.图谱无信号1.1、质粒培养，转化或其他随机原因使质粒上引物序列发生变化，导致无结合位点1.1.1同一模板两端引物测序均无信号，浓度不好安排重抽，反之停止实验，建议客户确认后重新送样1.1.2同一模只一端无信号，确认不是空载体，安排重新实验或换同序列其他引物，两次测序无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通。
反之建议客户单向测通1.1.3客户提供序列我司合成引物，二次实验仍无信号则停止实验，建议客户提供载体图谱或目的基因我处给他设计引物测序1.1.4客户提供序列我司设计并合成引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功则停止实验，请客户确认提供的序列是否和模板相匹配1.1.5我司设计并合成的步行引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功可重设引物或换另一端测通。
1.1.6某一通用引物测序无信号先查看当天该引物的其他实验或近期该引物的实验情况，均无信号则换管引物重新实验，当天该引物的其他实验有成功的，该反应重做1.1.7一订单多样品用同一对引物测序，某条引物测序均无信号，若为客户提供引物则停止实验。
若为通用引物有同序列其他引物，在确认不是空载载体的情况下，安排换引物试作三至四个反应，效果好全部安排用该引物测序；效果不好都停止实验。
客户要求测通的安排单向测通，反之建议单向测通。
1.1.8重摇重抽测序无信号则取消，建议重新提供样品1.1.9客户提供质粒直接测序无信号则停止实验，建议客户提供新鲜菌液1.1.10用PCR引物测序无信号可换备用引物测序，无备用引物停止实验，建议用载体上引物测序。
1.2、PCR 产物1.2.1同一模板两端引物测序均无信号则停止实验，建议客户克隆后测序1.2.2 同一模只一端无信号，安排重新实验, 仍无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通，反之建议步行测通2. 图谱信号弱可参考原始峰图，对不能出报告的峰图的处理如下：2.1 同一模板某一端，可安排提高浓度梯度重新实验2.2 某一模板或一订单多个模板中的一个模板2.2.1 鉴定浓度正常可安排提高浓度梯度重新实验，效果仍不好可作弱stop处理2.2.2 一次抽提出的质粒亮度弱，可安排重新抽提质粒后测序2.2.3 二次抽提出的质粒亮度弱，可停止实验，建议重新提供样品3 双峰3.1 PCR 产物测序3.1.1 引物不纯，引物客户提供该结果可出，引物我司合成安排重合引物3.1.2 引物特异性差，有双或多结合位点，可换备用引物测序，无备用引物即出结果3.1.3 polyT/A/G/C 出结果，单向建议客户换另一端测序。
全基因组测序质粒类型
全基因组测序质粒类型全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高度精确的基因检测技术，通过对一个人的全基因组进行测序，可以揭示其遗传信息。
在基因测序过程中，质粒（Plasmid）作为载体发挥着至关重要的作用。
质粒是一种小型环状DNA分子，具有自主复制能力，可以携带外源基因并在受体细胞中进行表达。
因此，质粒在全基因组测序中扮演着关键角色，不同类型的质粒影响着测序的准确性和效率。
一、质粒类型概述目前，常用的全基因组测序质粒类型主要有两种：测序适配子（Sequencing Adapters）和测序引物（Sequencing Primers）。
1.测序适配子：测序适配子是连接测序仪器读取的片段与目标序列的一段短DNA片段。
在测序过程中，测序仪器读取的是测序适配子与目标序列相互连接的片段。
因此，测序适配子的选择对于全基因组测序的准确性至关重要。
2.测序引物：测序引物是用于引导DNA复制的短DNA片段。
在全基因组测序过程中，测序引物可以与目标序列上的特定区域相互结合，从而引导测序仪器读取目标序列。
引物的设计和选择会影响到测序的准确性和覆盖度。
二、全基因组测序质粒类型的选择与优化1.测序适配子的选择：为提高测序准确性，通常需要选择与目标序列匹配度高、GC含量适中、无重复序列的测序适配子。
此外，还需要考虑测序适配子的长度、硬度等因素，以保证在测序过程中能够稳定地连接目标序列。
2.测序引物的选择：优化测序引物设计是提高全基因组测序覆盖度和准确性的关键。
在选择测序引物时，应考虑以下因素：（1）引物长度：引物长度会影响到测序仪器的读取效果。
通常情况下，引物长度在10-20个碱基对之间为宜。
（2）引物Tm值：引物的Tm值（退火温度）会影响到引物与目标序列的结合效率。
Tm值过高或过低都会导致测序准确性下降，因此需要选择Tm值适中的引物。
（3）引物间的差异：为减少引物间的相互干扰，引物设计时应尽量选择具有较高特异性的引物，并确保引物间的序列差异足够大。
质粒构建流程
质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
质粒目的基因插入及引物设计流程
嵌套式引物设计
设计两对引物，其中一对引物位于 另一对引物的内部，通过两轮PCR 反应提高扩增的特异性和灵敏度。
使用通用接头
在靶序列两端添加通用接头序列， 然后针对接头序列设计通用引物进 行PCR扩增。这种方法适用于多个 不同靶序列的扩增。
04
实验操作流程详解
质粒提取与纯化方法
1 2
质粒提取
从含有目标质粒的细菌培养物中提取质粒，通常 使用碱裂解法或煮沸法。
插入策略选择
01
根据实验需求和目的基因特点，选择合适的质粒载体和插入策 略。
02
可采用定向克隆、同源重组或位点特异性重组等方法将目的基
因插入质粒。
插入策略需考虑质粒的稳定性、复制效率、表达水平及筛选方
03
法等因素。
03
引物设计原则与方法
引物设计基本原则
引物长度
通常引物长度为18-24个碱基，过长或过短都会影响PCR的特异性和效率。
将测序结果与已知的基因序列进行比对，检查插入的 基因片段是否正确、完整。
验证结果
通过比对分析，验证质粒中是否成功插入了目的基因， 并确认插入的位置和方向是否正确。
数据分析方法介绍
序列比对算法
利用BLAST等序列比对算法，将 测序结果与数据库中的已知序列 进行比对，找出相似度高的序列。
统计分析方法
对测序结果进行统计分析，包括 碱基组成、GC含量、重复序列等， 以评估测序数据的质量和可靠性。
可视化工具
利用生物信息学可视化工具，如 IGV等，对测序结果进行可视化展 示，方便直观地查看和分析数据。
06
实验注意事项与问题解决方案
实验操作规范及安全注意事项
严格遵守实验室安全规定， 穿戴好实验服、手套和护 目镜等防护用品。
质粒PCR
中都重新加酶。
这样寡核苷酸引物的退火和延伸可以在
更高温度下进行，使引物和模板的误配大大
减少。
PCR的基本原理
PCR 的应用 品种鉴定； DNA筛选； 直接测序； 研究进化关系； 克隆基因； 环境中致病菌和指示菌的polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。
PCR的基本原理
PCR：polymerase chain reaction 模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP 缓冲液 ddH2O
PCR的基本原理
引物2 模板
引物1 （10-30bp）
DNA聚合酶 dNTP Mg2+
根据已知信 息设计引物 序列
PCR的基本原理
热 变 性
退火
延 伸
I
PCR的基本原理
退 火
延 伸
II
PCR的基本原理
以此类推，呈几何级增长
一般进行25-35个扩增循环 DNA可扩增106~109倍
PCR的基本原理
Taq DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶，是从水生噬热菌中提纯 出来的，经 95 ℃持续温育仍有活性，不会在 加热变性的步骤中失活，故无需在每轮反应
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GAL4 ADfor
pGAL4-ADrv
pACT2
p17110
p12584
pACYC184(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pACYCDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pACYCDuet-1(MCSII)
DuetUp2
T7-Terminator
M13R
pEASY-T3
M13F/T7
M13R/SP6
pECFP-N(C)
PECFP-N-5.
PECFP-N-3,
pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc
pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/myc-His)
T7/pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/V5-His)
pDSRED-N1(KAN+)
pEGFP-N-5’
pDSRED-N-R
pEASY-Blunt
M13F
T7/ M13R
pEASY-BluntSimple
M13F
T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1 Simple
M13F
M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1
M13F/T7
pBridge(MCSI)
GAL4-Bdfor
3'BD
pBridge(MCSII)
not available
not available
pBS-T II
T3/M13rev
T7/M13for
pBS（AMP）
T7
T3
pBSR
T3
T7ter
pBudCE4.1(MCSI)
CMV-Profor,T7
c-mycrev,EBVrev
pDONR223
M13F
M13R
pDrive
T7/M13rev
SP6/M13for
pDsRED1-C1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed1-N1
CMV-Profor
RFP-Nrev,CMV-R?
pDsRed2-N1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed2-C1
BGH rev
pcDNA6/myc-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,c-mycrev
pcDNA6/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pCEP4
pCEP-F/CMV-Profor
EBVrev
pCI
T7（17BASE）
pCAMBIA1301(1300)
pCAMBIA1301-5'(ECORI)/M13R
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA1304
pCAMBIA1301-5'(ECORI)
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA2300
M13R(-48)
M13F(-47)/M13F(-49)
T7-Terminator
pET-20b(+)
T7
T7-Terminator
pET-21(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-22b(+)
T7
T7-Terminator
pET-23(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-24(-a,-b,-c,-d)(+)
BAC1
BAC2
pBAD
pBAD-F
pBAD-R
pBAD/HisABC
pBAD-5'
pBBR1MCS
T3/M13rev
T7/M13for
pBD-GAL4
pBD-GAL4-F
PBD-GAL4-R
pBI121
35S
NOS
pBIND
GAL4-Bdfor
T3,EBVrev
pBK-CMV
M13F/T7
M13R/T3
pCR3.1
T7
BGH rev
pCR3.1-Uni
T7
BGH rev
pCR4
T3/M13rev
T7/M13for
pCR4-Blunt
T3/M13rev
T7/M13for
pCR4-TOPO
M13rev,T3
M13for,T7
pCR-Blunt
M13rev
T7,M13for
pCR-BluntII
M13rev/SP6
T7
T7-Terminator
pET-25b(+)
T7
T7-Terminator
pET-26b(+)
T7
T7-Terminator
pET-27b(+)
T7
T7-Terminator
pET-28a(-b,-c)(+)
T7
T7-Terminator
pET-29a(-b,-c)(+)
S.tag/T7
T7-Terminator
T7/CMV-Profor
BGH rev/c-mycrev
pcDNA3.1/V5-His(_A,_B,_C)
T7/CMV-Profor
BGH rev/V5rev
pcDNA3.1/Hygro(+,-)
T7/CMV-Profor
BGH rev/V5rev
pcDNA3.1/Zeo(+.-)
T7
BGHrev
载体名称
上游引物（5'primer）
下游引物（3'primer）
P3*FLAG-CMV
CMV-30(825-854)
CMV-24(1129-1152)
pAc5.1/V5-His(_A,_B,_C)
pAc5-5
BGH rev
pAcG2T
pGEX-5
not available
pACT
T7EEV
T3/EBVrev
T7,CMV-Profor
BGH rev,c-mycrev
pcDNA4/TO
TREfor/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA4/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pcDNA4-TET/ON/AMP+
CMV-Profor
pcDNA5/FRT
T7/CMV-Profor
pET-12(-a,-b,-c)
T7
T7-Terminator
pET-14b
T7
T7-Terminator
pET-15b
T7
T7-Terminator
pET-16b
T7
T7-Terminator
pET-17b
T7
T7-Terminator
pET-17xb
T7
T7-Terminator
pET-19b
T7
pCANTB5E
S1
S6
pCAT3-enhancer
RVP3
此载体无反向引物
pCDFDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCDFDuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pcDNA1.1
CMV-Profor,T7
pCDM8-3
pcDNA2.1
M13for/T7
pEGFP-N
PEGFP-N-5′
PEGFP-N-3′
pEGFP-N1
CMV-Profor
EGFP-Nrev
pEGFP-N2
CMV-Profor
EGFP-Nrev
pEGFP-N3
CMV-Profor
EGFP-Nrev
pENTR
M13F
M13R
pET-11(-a,-b,-c,-d)
T7
T7-Terminator
pAdEasy-1
not available
not available
pAdTrackt available
pAS2-1
GAL4 Bdfor/P24990
pGAL4-BDrv/P31430
pB42AD
pB42ADF
PB42ADR
pBABE
pBMN_5'
pBacPAK8
pBudCE4.1(MCSII)
EF-1α Fwd
BGH
pBudCE4.1/lacZ/CAT
CMV-Profor,T7
c-mycrev,EBVrev
pBV220
pBV220F
PBV220R
pCAL-c
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
pCAL-n
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
EBVrev
pCI-neo
T7（17BASE）
EBVrev,T3
pCMS-EGFP
T7
T3
pCMS-EGFP
T7
EBVrev,T3
pCMV-3Tag-4A
T3 /PFLAG-CMV-F
T7
pCMV5
pCMV5F
PCMV5R