实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染 2p

绝大多数沙眼衣原体 ( Ch lam yd ia trachom a tis, CT)感染发生在 16 ～24 岁左右 , 约 70%女性 、 50% ～60%男性的感染者无明显症状
[ 12 3]
。目前 CT 检
收集首段尿样约 1 m l, 与 1 m l样本保存液 ( SAT试 剂盒组分 )混匀 , - 20 ℃ 保存 ,用于 SAT检测 。 1. 3 主要试剂及仪器 CT核酸检测试剂盒 ( RNA 恒温扩增 ) (上海仁度公司 ) ; CT核酸 PCR 荧光检 测试剂盒 (深圳匹基公司 ) ; CT培养用 M cCoy 细胞 系 ; NPA 2 32 半自动核酸提取仪 (杭州博日公司 ) ; 实 时荧光扩增仪 (B io 2 Rad 公司 iQ 5 ) 。 1. 4 实时荧光核酸恒温扩增 ( CT2SAT) 技术原理 同一温度下 , 首先通过 M 2 MLV 逆转录酶产生靶标 核酸 ( RNA ) 的一 个双 链 DNA 拷贝 , 然 后利 用 T7
分 )的标本冷冻保存管中 ,并混匀 ; 上述标本均置于
- 20 ℃ 保存 , 用于 SAT及 PCR 检测 。用于培养的
标本采集 ∶ 将拭子采集的分泌物标本洗入 1 m l衣原 体运送培养基中 , 用于衣原体培养实验 。用于核酸 检测的尿标本采集 ∶ 采集标本之前 2 h 内不排尿 。
检测结果的符合率分析采用 χ 检验 , P < 0. 05 有统 计学意义 。
PCR 检测 。操作按试剂盒说明书进行 。 1. 7 统计学分析 CT2SAT对拭子标本和尿液标本
子采集分泌物 : 用特制无菌棉拭子伸入男性尿道口 或女性宫颈口采集分泌物标本 , 采样后拭子在 1. 5
m l生理盐水中洗涤 。将该洗液震荡混匀后 , 吸取 1 m l至另一只装有 1 m l样本保存液 ( SAT 试剂盒组
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・
临床检验杂志 2010 年 7 月第 28 卷第 4 期 Chin J Clin Lab Sci, July 2010, Vol . 28, No. 4
2. 1 CT细胞培养和 CT2SAT检测结果 229 例疑
术 ,能够对病人泌尿生殖道分泌物及尿样标本进行
N eisseria gonorrhoeae: results from a multicenter evaluation of the
结果为参比 , 对结果有差异的样品 , 补充结合 PCR 结果为“ 扩大金标准 ” ,得出 SAT技术对临床拭子标 本的检 测灵 敏度 为 97. 1% ( 101 /104 ) , 特 异 性 为
RNA 多聚酶从该 DNA 拷贝上产生 100 ～ 1 000 个 RNA 拷贝 ; 每一个 RNA 拷贝再从逆转录开始进入
测法都是以病人的泌尿生殖道分泌物作为检测标 本 ,容易增加病人的取样痛苦 , 降低病人的检测意 愿 ,同时在敏感性和特异性以及报告时间上都有不 足 。我们于 2008 年 3 ～6 月 , 采用以实时荧光核酸 恒温 扩 增 检 测 技 术 ( sim ultaneous amp lification and
[7]
阳性
86 15 101
阴性
2 126 128
CT2SAT(尿样 )
阳性
83 11 94
阴性
5 130 135
阴性 合计
2. 2 实时荧光 PCR 检测结果 229例受检者中有 22
例受检者的 CT2SAT拭子和尿样结果与细胞培养结 果有差异 ,按照实验设计对这 22 例受检者留存的生 理盐水标本 (拭子来源 )进行 PCR 检测 ,结果见表 2。
100% ( 125 /125 ) ; 对 尿 样 标 本 的 检 测 灵 敏 度 为 89. 4% ( 93 /104 ) , 特异性为 99. 2% ( 124 /125 ) 。结
Int J STD
果见表 3。
表 3 CT2SAT检测结果与“ 扩大金标准 ” 的比较
“ 扩大金标准 ” 阳性 阴性 合计
RNA 拷贝特异结合 ,产生荧光 。该荧光信号可由荧
就诊的疑似患者 , 共计 229 例 。分别采集相应分泌 物和尿样标本 (男性尿道拭子及尿样 , 女性宫颈拭 子及尿样 ) 。
1. 2 标本采集 采集标本前 2 h 内不排尿 。用拭
光检测仪器实时捕获 ,直观反映扩增循环情况 。
1. 5 CT细胞培养检测 参见文献
临床检验杂志 2010 年 7 月第 28 卷第 4 期 Chin J Clin Lab Sci, July 2010, Vol . 28, No. 4
・
文章编号 : 1001 2 764X ( 2010 ) 04 2 271 2 02
・临床检验技术研究 ・
实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染
[4]
进行 。
1. 6 样品检测 收集的一份拭子标本做细胞培养 ,
另外一份拭子标本 、 一份尿样标本进行 SAT检测实 验 ,分别获得拭子标本和尿样标本 2 个检测结果 。 若 SAT检测结果与细胞培养结果不符 , 以及同一受 检者的尿样与拭子 SAT结果不一致时 , 均采用深圳 匹基公司 CT2PCR 试剂盒进行拭子标本的实时荧光
顾伟鸣 ,杨阳 ,吴磊 ,莫小辉 (上海市皮肤病性病医院检验科 ,上海 200050 )
摘要 : 目的 评价实时荧光核酸恒温扩增技术 ( sim ultaneous amp lification and testing, SAT) 检测沙眼衣原体 ( CT) 核酸试剂盒
( RNA 恒温扩增 )的敏感性和特异性 。 方法 对 229 例临床疑似患者的尿样及拭子标本同时进行 SAT检测和“ 金标准 ” 沙眼衣
testing, SAT)开发的 CT核酸检测试剂盒 ( RNA 恒温
扩增 ) ,对我院性病门诊疑似患者的拭子分泌物及尿 样标本进行 CT检测 ,并评估其敏感性和特异性 。
1 材料与方法 1. 1 标本来源 2008 年 3 ～6 月来我院性病门诊
下一个扩增循环 ; 同时 ,带有荧光标记的探针和这些
4 参考文献
[ 1 ] Gopalakrishnakone D , Appan DP, Singh K . Prevalence of Chlam ydia
trachom a tis in Singaporean women undergoing term ination of p regnan2
CT培养 阳性 CT2SAT (拭子 )
体 RNA ,因活菌中才有完整的 RNA 片段 , 故能排除 患者治疗后病灶处残留的衣原体 DNA 对检测结果 的影响
[ 52 6]
。另外 ,尿样作为一种非侵入性的取样标
本 ,也很有临床应用价值 。 本次试验研究中 , CT2SAT实验结果阳性 、 而 CT 细胞培养结果阴性的标本可能是细胞培养敏感性不 足造成的 ,这部分标本经 PCR 实验后得到验证 。对 于 CT2SAT在少部分拭子标本及尿样标本检测中的 结果差异 ,我们分析可能是由于 CT 为细胞内寄生 物 ,尿样中的 CT 含量较低或存在扩增抑制物等因 素有关 。对于 2 例细胞培养阳性 , CT2SAT 和 PCR 扩增检测均为阴性的标本 , 我们推测可能存在以下 情况 : 待测标本保存不当 , 导致核酸 ( DNA 或 RNA ) 的丢失 ; 标本中存在核酸扩增抑制物 ; 衣原体特异性 核酸序列的突变
表 2 CT细胞培养和 CT2SAT结果不一致标本的 PCR 结果
PCR 阳性
细胞培养 阳性 阴性
3 2 5 16 1 17
CT2SAT(拭子 )
。有待进一步研究 。
阳性
18 0 18
阴性
1 3 4
阴性 合计
2. 3 CT2SAT检测的敏感性及特异性 以细胞培养
cy[ J ]. Ann Acad Med Singapore, 2009, 38 ( 5) : 457 2 460. [ 2 ] Peterman TA , Newman, Goldberg M , et a l . Screening male p rison2 ers for Ch lam ydia trachom a tis: impact on test positivity among women from their neighborhoods who were tested in fam ily p lanning clinics [ J ]. Sex Trans D is, 2009, 36 ( 7) : 425 2 429. [ 3 ] Yu JT, TangW Y, Lau KU , et a l . A symp tomatic urethral infection in male sexually trans m itted disease clinic attendees [ J ]. AI D S, 2008, 19 ( 3) : 155 2 158. [ 4 ]叶顺章 . 性传 播疾病 的实验 室诊断 [ M ]. 上 海 : 科 学 出 版 社 , 2001: 73 2 81. [ 5 ]Lowe P, O ′ Loughlin P, Evans K, et a l . Comparison of the gen 2 p robe APTI MA Combo 2 assay to the AMPL ICOR CT/NG assay for detec2 tion of Ch lam ydia trachom atis and N eisseria gonorrhoeae in urine samp les from Australian men and women [ J ]. J Clin M icrobiol, 2006, 44 ( 7) : 2619 2 2621. [ 6 ] Schachter J, CherneskyMA , W illis DE, et a l . Vaginal s wabs are the specim ens of choice when screening for Ch lam yd ia trachom a tis and
2 结果
2
作者简介 : 顾伟鸣 , 1962 年生 ,男 ,副主任技师 ,硕士 ,从事性病传播疾病实验诊断研究 , E 2 mail: weim ing_gu2003@ yahoo. com. cn。
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ห้องสมุดไป่ตู้
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CT的检测 。与 PCR 方法相比 , 该方法只检测病原
似患者 CT2SAT检测拭子分泌物标本和尿样标本阳 性率分别为 44. 1% ( 101 /229 ) 和 41. 0% ( 94 /229 ) , 细胞培养法阳性率 (拭子标本 )为 38. 4% ( 88 /229 ) , 见表 1。
表 1 沙眼衣原体细胞培养和 CT2SAT检测结果
2 符合率为 95. 2% ,经卡方检验 ,差异无显著性 (χ = 3. 27, P > 0. 05) 。结论 SAT技术检测 CT试剂盒对拭子及尿样标本敏感
性及特异性均较好 ,适用于临床实验室对 CT的检测 。 关键词 : 沙眼衣原体 ; 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 ; 尿样检测 中图分类号 : R374 + . 1 文献标识码 : A
原体细胞培养检测 ,检测结果有差异的标本采用 PCR 方法对拭子标本进行复测 ,根据实验结果评估 SAT技术在尿样及拭子标 本检测中的敏感性和特异性 。结果 结合细胞培养和 PCR 的实验结果作为“ 扩大金标准 ” ,得出 SAT技术对临床拭子标本的 检测敏感性为 97. 1% ,特异性为 100% ; 对尿样标本检测的敏感性为 89. 4% ,特异性为 99. 2% 。拭子和尿样标本检测结果的