分离分析法导论
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第2章 分离分析法导论
内容提要
一、概述 二、色谱法的分类 三、色谱图及常用术语 四、色谱分析法的基本理论 五、色谱定性和定量的方法
一、概述
将先分离后分析的仪器分析方法称为分离 分析法。 利用组分间吸附、分配、交换、迁移速率 等差异，先分离然后通过检测器按一定顺 序进行分析测定。 色谱分析法（气相色谱、高效液相色谱） 毛细管电泳法 色谱-质谱、色谱-光谱联用
色谱法，（ Chromatograph ）已成为一种重 要的分离、分析技术，分离分析复杂组分最有效 的方法之一。它是各种分离技术中效率最高和应 用最广的一种方法。 现代色谱分析法已成为既能分离混合物，又 能定性、定量分析的现代仪器分析方法。 特别是近三十年来，由于 GC 和 HPLC 的迅猛发 展，色谱分析已广泛应用于各个领域，并形成了 一门新兴学科－色谱学。
Developing of Chromatographic Technique
色谱流出曲线的意义
1.色谱峰数，表明样品中所含组分的最少数量；
2.根据色谱峰的保留值进行定性； 3.根据色谱峰的峰高或峰面积进行定量； 4.根据色谱峰的位置和区域宽度，评价色谱系统； 5.根据两色谱峰之间的距离和分离度， 评价色谱条 件的合适性。
W1/2=2.354
（3）峰底宽Wb：色谱峰两侧拐 点上切线与基线的交点间的距 离，图中IJ 。
Wb = 4
4.峰面积A---色谱定量的依据 峰面积的测量方法： （1）数学近似测量法（见公式） 对称峰 A=1.065hW1/2 （峰高乘半峰宽） （2）真实面积测量法（ 微机处理）
RT: 39.76 - 60.64 100 95 90 85 80 75 70 65 50.20 NL: 1.02E8 TIC MS ganlan3
60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0.0 3.23 0.54 0.5 1.0 1.5 1.75 2.0 2.5 3.0 3.77 3.5 Time (min) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.01 6.0 6.5 6.77 7.0
峰宽 基线
RT: 0.00 - 105.00 100 95 90 85 80 75 70 65 59.00 NL: 2.92E7 TIC MS mogu0719
二、色谱法的分类（掌握）
1、 按两相所处状态
总称 气相色谱 液相色谱 流动相 气 体 液 体 固定相 固 体 液 体 固 体 液 体 色谱名称 气－固色谱 气－液色谱 液－固色谱 液－液色谱
2、按固定相形状（或载体） （1）柱色谱：固定相装在柱管内的色谱法 分为两类：一类是固定相填充于玻璃或金属管内 叫填充柱色谱；另一类是固定相附着或键合在管 的内壁上，中心是空的，叫空心毛细管柱色谱或 毛细管柱色谱。
三、色谱图常用术语
（一）基本术语：
1.基线(Baseline):当色谱柱后没有组分进入检测器,仅有 流动相通过检测器时，检测器所产生的响应值；实验条件稳 定时的基线是一条平行于横轴的直线。
2.峰高h（peak height） 从峰最大值（峰顶）到峰底的垂直距离。
3.区域宽度（峰宽）： 通常有三种表示方法： （1）标准偏差：0.607倍峰 高处色谱峰宽度的一半，图中 EF的一半。 （2）半峰宽W1/2：峰高一半处 的峰宽，图中GH 。
U型填充柱
毛细管色谱柱
2、按固定相形状（或载体）
（2）纸色谱 （3）薄层色谱
3、按分离机制
（1）吸附色谱它是利用固体吸附剂（固定相）表面对各组分 吸附能力强弱的不同进行分离的色谱法。 （2）分配色谱它是利用固定液对各组分的溶解能力（分配系 数）不同进行分离的色谱法。
（3）离子交换色谱利用离子交换剂（固定相）对各组分的亲
16s
59s
9.总分离效能指标(分离度R)
分离度 R 定义为：相邻二组分的色谱峰保留值之 差与两峰宽总和的一半的比值。
影响两组分分离的因素为组分的迁移和自身的扩散
分离度R的值越大，说明相邻两组分分离效果越好。 对一般分析要求R在1~1.5之间。
Over-all resolution efficiency（总分离效能 指标）:
色谱图
色谱参数
1.基线 2.色谱峰高 3.色谱峰宽 4.峰面积 5.保留值 6.分配系数K 7.容量因子（分配比k’） 8.相对保留值γ 21 （分离因子，α ） 9.分离度R
四、色谱分析的基本理论
塔板理论 速率理论
（一）Martin和Synge的平衡塔板理论
（1941年提出，获1953年度Nobel奖）
保留体积 4. 死体积V0(Dead Volume) V0=t0.Fo 5. 保留体积VR(Retention Volume) VR=tR.Fo 6. 调整保留体积(Adjusted retention volume) V’R=t’R.Fo或 V’R=VR-V0
色谱图常用术语
小结
分离分析法概念 色谱分离的基本原理 色谱分析法分类 色谱图
和力不同进行分离的色谱法。 （4）凝胶色谱它是利用某些凝胶（固定相）对分子大小、形 状不同的组分所产生的阻滞作用不同进行分离的色谱法。
各种色谱法的共同点：
（1）分离系统都包含两相；
（2）色谱分离的基本过程相同；
（3）都要求不同组分在色谱系统中有不同的 迁移速度（分配系数k）；
（4）影响分离的因素（扩散）。
RT: 0.00 - 7.02 SM: 15G 100 95 90 85 80 75 70 65
Relative Abundance
4.91
保留时间
色谱峰
NL: 8.92E3 TIC F: + c SRM ms2 465.30@23.00 [ 419.30-421.30] MS drugx_01
色 谱 图
Relative Abundance
60 55 50 45 40 35 30 25 20 47.54 15 46.00 10 5 0 40 42 44 46 48 50 Time (min) 52 54 56 58 60 42.33 42.97 44.41 45.14 46.26 48.48 50.45 53.51 52.33 54.44 56.11 57.84 58.69 59.40 48.36 51.96
Developing of Chromatographic Technique
5、色谱保留值（Retention Value）--色谱定性的依据 表示试样中各组分在色谱柱中的滞留行为。 保留时间
1. 死时间 t0(Dead time)O’A’ 2. 保留时间 tR(Retention time)O’B 3. 调整保留时间 t’R(Adjusted retention time)A’B， t’R=tR-t0
RT: 39.76 - 60.64 100 95 90 85 80 75 70 65 50.20 NL: 1.02E8 TIC MS ganlan3
Relative Abundance
60 55 50 45 40 35 30 25 20 47.54 15 46.00 10 5 0 40 42 44 46 48 50 Time (min) 52 54 56 58 60 42.33 42.97 44.41 45.14 46.26 48.48 50.45 53.51 52.33 54.44 56.11 57.84 58.69 59.40 48.36 51.96
分离因子（选择性因子） 反映不同组分与固定相作用力的差异
α =1 该两组分热力学性质相同，不能分离 α ≠1 两组分才有可能分离
思考：
例题：P193【例9-1 】
例题：9-2 组分a的色谱图如下， (1)求该组分的分配比k'； （2）若该组分的分配系数为53.8，则该色 谱柱的相比为多少？
进样
空气 组分a
（一）色谱分析法简介
色谱法是一种分离和分析方法。色谱 法主要有气相色谱法和液相色谱法等。 利用各组分在固定相和流动相中受到 的作用力不同，而将待测样品中各组分分 离，然后顺序检测各组分含量。
（二）色谱法的发展
1906年，俄植物学家茨维特（M.Tswett）分离植物色素。
植物叶的色素组成
叶绿素a（蓝绿色）
R<1两峰重叠； R=1，4%重叠; R＝1.5，分离程度可达99.7% 。 因此，R=1.5,作为相邻两峰已完全分开 的标志。
R=1.5
完全分离
例9-3
从色谱图中得知两组分的色谱峰tR1=27s,
tR2=32s, W1=5.0mm, W2=10.3mm,记录仪的 走纸速度为2.5mm/s, 求此二峰的分离度。此二 峰是否能完全分离？
三、色谱图及常用术语
色谱分析时，混合物各组分经色谱柱分离后，随流 动相依次流出色谱柱，经检测器把各组分的浓度信 号转变为电信号，然后用记录仪将组分的信号记录 下来。色谱图就是组分在检测器上产生的信号强度 对时间t所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱 的情况所以又叫色谱流出曲线，由于电信号（电压 或电流）强度与物质的浓度成正比，所以流出曲线 实际上是浓度-时间曲线，正常的色谱峰为对称的正 态分布曲线。
（二） 色谱分离的原理 （掌握）
当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中 固定相发生相互作用（吸附等），由于混合物中 各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相 发生作用的大小、强弱不同，当流动相通过时， 组分溶解于流动相中称为解吸，如此在色谱柱上 不断发生吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。 结果使不同组分在固定相中的滞留时间有长有短， 从而按先后的次序从固定相中分离出来。
思考
1、什么是分离分析法？ 2、色谱分离的基本原理。 3、色谱分析法分类。 4、色谱图是什么样的图谱？色谱曲线的意义？
色谱图常用术语
决定组分保留值的因素 6、分配系数:平衡状态下，组分在固定相与 流动相中的浓度之比。
K=Cs/Cm
较长。
7、容量因子（分配比k’）
Relative Abundance
60 55
39.70
72.51 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) 70 80 90 100 2.88 12.44 9.00 28.14 17.84 24.97 38.64 51.76 73.59 78.95 86.40 97.23 45.34 57.65 85.02 68.53 50.21 61.54 42.56
组分分离示意图 （见P189图9-2）
A+B
B A B A B A B A B A
载气 仪
检测器
记录
C
A
B
色谱过程是组分分子在两相（固定相和流动 相）间分配‘平衡’的过程。
若各个组分被流动相携带移动的速率不等， 则形成差速迁移而被分离。
Developing of Chromatographic Technique
叶绿素b（黄绿色） 胡萝卜素（橙色） 叶黄素（黄色）
石油醚
b a
组成：色谱柱，固定相，流动相。 固定相：使混合物中各组分在两相间进行分 配，其中一相是不动的称为固定相。 流动相：携带混合物流过此固定相的流体， 称为流动相。
思考：叶绿体色素为什么分离开了？
用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色 素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随 着淋洗的进行，不同色素向下移动的速 度不同，形成一圈圈不同颜色的色带， 使各色素成分得到了分离。
k’ =CSVS/CmV m = s β= Vm/V两相的相比 K VS/V =m K/β
k’ = tR’ / t0 = VR’/V0
K’值大的组分在柱中滞留时间长，较迟出峰。
8. 相对保留值γ 21(Relative retention value) 或用α 表示： γ 21=t’R2/t’R1=V’R2/V’R1=k2’/k1’=K2/K1
1. 塔板理论的基本假设
将连续的色谱过程，视为许多小段 平衡过程的重复；
将色谱柱比作为分馏塔，载气占据的 空间，为板体积Δ V 。
塔板理论的假设:
(1) 在板体积内，气相和液相的平均组成， 瞬间达到平衡。达到分配平衡的一小段柱长， 称为理论塔板高度H；
(2) 载气进入色谱柱，是脉冲式的，每次 进气量为1 Δ V ； (3) 样品开始都是加在第0号板上，而且样 品沿着色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略 不记；
内容提要
一、概述 二、色谱法的分类 三、色谱图及常用术语 四、色谱分析法的基本理论 五、色谱定性和定量的方法
一、概述
将先分离后分析的仪器分析方法称为分离 分析法。 利用组分间吸附、分配、交换、迁移速率 等差异，先分离然后通过检测器按一定顺 序进行分析测定。 色谱分析法（气相色谱、高效液相色谱） 毛细管电泳法 色谱-质谱、色谱-光谱联用
色谱法，（ Chromatograph ）已成为一种重 要的分离、分析技术，分离分析复杂组分最有效 的方法之一。它是各种分离技术中效率最高和应 用最广的一种方法。 现代色谱分析法已成为既能分离混合物，又 能定性、定量分析的现代仪器分析方法。 特别是近三十年来，由于 GC 和 HPLC 的迅猛发 展，色谱分析已广泛应用于各个领域，并形成了 一门新兴学科－色谱学。
Developing of Chromatographic Technique
色谱流出曲线的意义
1.色谱峰数，表明样品中所含组分的最少数量；
2.根据色谱峰的保留值进行定性； 3.根据色谱峰的峰高或峰面积进行定量； 4.根据色谱峰的位置和区域宽度，评价色谱系统； 5.根据两色谱峰之间的距离和分离度， 评价色谱条 件的合适性。
W1/2=2.354
（3）峰底宽Wb：色谱峰两侧拐 点上切线与基线的交点间的距 离，图中IJ 。
Wb = 4
4.峰面积A---色谱定量的依据 峰面积的测量方法： （1）数学近似测量法（见公式） 对称峰 A=1.065hW1/2 （峰高乘半峰宽） （2）真实面积测量法（ 微机处理）
RT: 39.76 - 60.64 100 95 90 85 80 75 70 65 50.20 NL: 1.02E8 TIC MS ganlan3
60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0.0 3.23 0.54 0.5 1.0 1.5 1.75 2.0 2.5 3.0 3.77 3.5 Time (min) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.01 6.0 6.5 6.77 7.0
峰宽 基线
RT: 0.00 - 105.00 100 95 90 85 80 75 70 65 59.00 NL: 2.92E7 TIC MS mogu0719
二、色谱法的分类（掌握）
1、 按两相所处状态
总称 气相色谱 液相色谱 流动相 气 体 液 体 固定相 固 体 液 体 固 体 液 体 色谱名称 气－固色谱 气－液色谱 液－固色谱 液－液色谱
2、按固定相形状（或载体） （1）柱色谱：固定相装在柱管内的色谱法 分为两类：一类是固定相填充于玻璃或金属管内 叫填充柱色谱；另一类是固定相附着或键合在管 的内壁上，中心是空的，叫空心毛细管柱色谱或 毛细管柱色谱。
三、色谱图常用术语
（一）基本术语：
1.基线(Baseline):当色谱柱后没有组分进入检测器,仅有 流动相通过检测器时，检测器所产生的响应值；实验条件稳 定时的基线是一条平行于横轴的直线。
2.峰高h（peak height） 从峰最大值（峰顶）到峰底的垂直距离。
3.区域宽度（峰宽）： 通常有三种表示方法： （1）标准偏差：0.607倍峰 高处色谱峰宽度的一半，图中 EF的一半。 （2）半峰宽W1/2：峰高一半处 的峰宽，图中GH 。
U型填充柱
毛细管色谱柱
2、按固定相形状（或载体）
（2）纸色谱 （3）薄层色谱
3、按分离机制
（1）吸附色谱它是利用固体吸附剂（固定相）表面对各组分 吸附能力强弱的不同进行分离的色谱法。 （2）分配色谱它是利用固定液对各组分的溶解能力（分配系 数）不同进行分离的色谱法。
（3）离子交换色谱利用离子交换剂（固定相）对各组分的亲
16s
59s
9.总分离效能指标(分离度R)
分离度 R 定义为：相邻二组分的色谱峰保留值之 差与两峰宽总和的一半的比值。
影响两组分分离的因素为组分的迁移和自身的扩散
分离度R的值越大，说明相邻两组分分离效果越好。 对一般分析要求R在1~1.5之间。
Over-all resolution efficiency（总分离效能 指标）:
色谱图
色谱参数
1.基线 2.色谱峰高 3.色谱峰宽 4.峰面积 5.保留值 6.分配系数K 7.容量因子（分配比k’） 8.相对保留值γ 21 （分离因子，α ） 9.分离度R
四、色谱分析的基本理论
塔板理论 速率理论
（一）Martin和Synge的平衡塔板理论
（1941年提出，获1953年度Nobel奖）
保留体积 4. 死体积V0(Dead Volume) V0=t0.Fo 5. 保留体积VR(Retention Volume) VR=tR.Fo 6. 调整保留体积(Adjusted retention volume) V’R=t’R.Fo或 V’R=VR-V0
色谱图常用术语
小结
分离分析法概念 色谱分离的基本原理 色谱分析法分类 色谱图
和力不同进行分离的色谱法。 （4）凝胶色谱它是利用某些凝胶（固定相）对分子大小、形 状不同的组分所产生的阻滞作用不同进行分离的色谱法。
各种色谱法的共同点：
（1）分离系统都包含两相；
（2）色谱分离的基本过程相同；
（3）都要求不同组分在色谱系统中有不同的 迁移速度（分配系数k）；
（4）影响分离的因素（扩散）。
RT: 0.00 - 7.02 SM: 15G 100 95 90 85 80 75 70 65
Relative Abundance
4.91
保留时间
色谱峰
NL: 8.92E3 TIC F: + c SRM ms2 465.30@23.00 [ 419.30-421.30] MS drugx_01
色 谱 图
Relative Abundance
60 55 50 45 40 35 30 25 20 47.54 15 46.00 10 5 0 40 42 44 46 48 50 Time (min) 52 54 56 58 60 42.33 42.97 44.41 45.14 46.26 48.48 50.45 53.51 52.33 54.44 56.11 57.84 58.69 59.40 48.36 51.96
Developing of Chromatographic Technique
5、色谱保留值（Retention Value）--色谱定性的依据 表示试样中各组分在色谱柱中的滞留行为。 保留时间
1. 死时间 t0(Dead time)O’A’ 2. 保留时间 tR(Retention time)O’B 3. 调整保留时间 t’R(Adjusted retention time)A’B， t’R=tR-t0
RT: 39.76 - 60.64 100 95 90 85 80 75 70 65 50.20 NL: 1.02E8 TIC MS ganlan3
Relative Abundance
60 55 50 45 40 35 30 25 20 47.54 15 46.00 10 5 0 40 42 44 46 48 50 Time (min) 52 54 56 58 60 42.33 42.97 44.41 45.14 46.26 48.48 50.45 53.51 52.33 54.44 56.11 57.84 58.69 59.40 48.36 51.96
分离因子（选择性因子） 反映不同组分与固定相作用力的差异
α =1 该两组分热力学性质相同，不能分离 α ≠1 两组分才有可能分离
思考：
例题：P193【例9-1 】
例题：9-2 组分a的色谱图如下， (1)求该组分的分配比k'； （2）若该组分的分配系数为53.8，则该色 谱柱的相比为多少？
进样
空气 组分a
（一）色谱分析法简介
色谱法是一种分离和分析方法。色谱 法主要有气相色谱法和液相色谱法等。 利用各组分在固定相和流动相中受到 的作用力不同，而将待测样品中各组分分 离，然后顺序检测各组分含量。
（二）色谱法的发展
1906年，俄植物学家茨维特（M.Tswett）分离植物色素。
植物叶的色素组成
叶绿素a（蓝绿色）
R<1两峰重叠； R=1，4%重叠; R＝1.5，分离程度可达99.7% 。 因此，R=1.5,作为相邻两峰已完全分开 的标志。
R=1.5
完全分离
例9-3
从色谱图中得知两组分的色谱峰tR1=27s,
tR2=32s, W1=5.0mm, W2=10.3mm,记录仪的 走纸速度为2.5mm/s, 求此二峰的分离度。此二 峰是否能完全分离？
三、色谱图及常用术语
色谱分析时，混合物各组分经色谱柱分离后，随流 动相依次流出色谱柱，经检测器把各组分的浓度信 号转变为电信号，然后用记录仪将组分的信号记录 下来。色谱图就是组分在检测器上产生的信号强度 对时间t所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱 的情况所以又叫色谱流出曲线，由于电信号（电压 或电流）强度与物质的浓度成正比，所以流出曲线 实际上是浓度-时间曲线，正常的色谱峰为对称的正 态分布曲线。
（二） 色谱分离的原理 （掌握）
当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中 固定相发生相互作用（吸附等），由于混合物中 各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相 发生作用的大小、强弱不同，当流动相通过时， 组分溶解于流动相中称为解吸，如此在色谱柱上 不断发生吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。 结果使不同组分在固定相中的滞留时间有长有短， 从而按先后的次序从固定相中分离出来。
思考
1、什么是分离分析法？ 2、色谱分离的基本原理。 3、色谱分析法分类。 4、色谱图是什么样的图谱？色谱曲线的意义？
色谱图常用术语
决定组分保留值的因素 6、分配系数:平衡状态下，组分在固定相与 流动相中的浓度之比。
K=Cs/Cm
较长。
7、容量因子（分配比k’）
Relative Abundance
60 55
39.70
72.51 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) 70 80 90 100 2.88 12.44 9.00 28.14 17.84 24.97 38.64 51.76 73.59 78.95 86.40 97.23 45.34 57.65 85.02 68.53 50.21 61.54 42.56
组分分离示意图 （见P189图9-2）
A+B
B A B A B A B A B A
载气 仪
检测器
记录
C
A
B
色谱过程是组分分子在两相（固定相和流动 相）间分配‘平衡’的过程。
若各个组分被流动相携带移动的速率不等， 则形成差速迁移而被分离。
Developing of Chromatographic Technique
叶绿素b（黄绿色） 胡萝卜素（橙色） 叶黄素（黄色）
石油醚
b a
组成：色谱柱，固定相，流动相。 固定相：使混合物中各组分在两相间进行分 配，其中一相是不动的称为固定相。 流动相：携带混合物流过此固定相的流体， 称为流动相。
思考：叶绿体色素为什么分离开了？
用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色 素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随 着淋洗的进行，不同色素向下移动的速 度不同，形成一圈圈不同颜色的色带， 使各色素成分得到了分离。
k’ =CSVS/CmV m = s β= Vm/V两相的相比 K VS/V =m K/β
k’ = tR’ / t0 = VR’/V0
K’值大的组分在柱中滞留时间长，较迟出峰。
8. 相对保留值γ 21(Relative retention value) 或用α 表示： γ 21=t’R2/t’R1=V’R2/V’R1=k2’/k1’=K2/K1
1. 塔板理论的基本假设
将连续的色谱过程，视为许多小段 平衡过程的重复；
将色谱柱比作为分馏塔，载气占据的 空间，为板体积Δ V 。
塔板理论的假设:
(1) 在板体积内，气相和液相的平均组成， 瞬间达到平衡。达到分配平衡的一小段柱长， 称为理论塔板高度H；
(2) 载气进入色谱柱，是脉冲式的，每次 进气量为1 Δ V ； (3) 样品开始都是加在第0号板上，而且样 品沿着色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略 不记；