胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞的研究进展

摘要：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。已经广泛用于生命科学的许多领域，它在医学方面的应用成为医学领域的研究热点。本文综述了近些年关于胚胎干细胞分离培养与鉴定特征和应用的研究进展，同时也指出了目前所面临的问题，对今后的研究方向进行了展望。

关键词：胚胎干细胞；分离培养与鉴定特征；应用

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞( primordial germ cells，PGCs) 中经分离体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞，与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现永生，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内中外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生细胞组织分化基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景[1,2]。

20世纪末开始，ES细胞的研究就一直是生物医学领域的热点。美国《科学》杂志评出的上个世纪十大科学突破中，“干细胞研究与应用”名列榜首。ES细胞的研究还处于起步阶段，目前人们已经能够分离培养干细胞，但诱导ES细胞定向分化还面临许多困难。

1 胚胎干细胞的概念和研究历史

胚胎干细胞研究的起源来自20世纪70年代对畸胎瘤的研究：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠体内后产生了畸胎癌( 即恶性的畸胎瘤) ，畸胎癌内的细胞( 即EC，胚胎癌细胞) 能在体外自我更新且能分化成不同种类的细胞，由于这种类型的畸胎癌只能由着床前的早期小鼠胚胎产生，因此推测EC细胞的来源是胚胎发育早期短暂出现的外胚层细胞( epiblast) 关于EC细胞的研究使科学家认为可能从小鼠早期胚胎中分离到一种能分化成多种细胞的具有全能性的干细胞，即胚胎干细胞( ESC)。

ES细胞研究，首先源于畸胎瘤干细胞(teratocarcinoma stem cell)或胚胎瘤细胞(embryoniccarcinoma cell , EC细胞)。1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了EC细胞。1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman[3]用延缓着床的胚泡和美国加州大学旧金山分校的Martin用条件培养基分别成功地分离、体外培养了小鼠的ES，从此进入了胚胎干细胞培养建系的新纪元。此后，人们建立了许多动物的ES细胞系，1990年，Evans[4]、Strojek[5]各自成功地建立了猪类ES细胞系。1992年，Matsui[6]等用小鼠原始生殖细胞首先建成EC细胞系，又开创了一种新的建立全能性(或多能性)细胞系的材料。1994年，Robert[7]用牛原始生殖细胞建成EC细胞系，证明了原始生殖细胞可以作为建立全能性(或多能性)细胞系的新型材料。1995年Thomson[8]等从恒河猴的胚囊中分离、建立了ES细胞株，这是第一个建株的灵长类动物的ES。近年来，美国Wiscosin大学的Thomson和Hopkins大学的Gearhart分别用不同的方法成功的得到了几个人的ES细胞系，这一工作奠定了对人ES实验研究的基础。国内在细胞胚胎干方面的综合性研究虽然起步较晚(1989年) ，但发展非常迅速，在基础研究方面，尚克刚赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛惠珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在应用研究方面，窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动

样细胞团，中国军事医学科学院发现了人胚胎干细胞素，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果[9]。

2 胚胎干细胞的特征

2.1 胚胎干细胞的生物学特征

ES细胞显著区别于其他细胞：（1）ES细胞具有全能性，体外培养可诱导分化成机体的任何组织细胞类型。细胞全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白[10]；（2）ES细胞具有无限增殖性，体外培养能在未分化状态下无限增值；（3）ES细胞具有种系传递功能；（4）ES细胞易于进行基因改造操作；（5）ES细胞保留了正常二倍体的性质且核型正常；（6）ES细胞能参与胚胎各组织器官的生长发育，获得包括生殖系在内的后代；（7）ES细胞多数处在细胞周期的S期，缺少G1期检测点；（8）在雌性哺乳动物的每个体细胞内，2个X染色体中的一个会永久失活，X失活不发生于未分化的ES细胞[11,12]。

2.2 胚胎干细胞的形态学特征

ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高，有一个或多个明显的核仁，核型正常，具有整倍性。在体外分化抑制性生长时，ES细胞呈克隆状生长，排列紧密，呈鸟巢集落状，难以看清细胞界限，集落边界清晰，有立体感用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色，小鼠ES细胞的直径为7 ～18 m，猪牛羊ES细胞的颜色较深，直径为12 ～18m [13]。

3 胚胎干细胞的分离与培养

3.1 胚胎干细胞的建系

ES细胞建系，来自由分离的内细胞群细胞从5 ～9周的胚胎生殖腺中分离ES细胞，

也用克隆技术将体细胞核移植到去核卵母细胞中，使之发育成囊胚，再分离其内细胞群细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。Hwang等[14]应用这种方法获得了胚胎干细胞1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES细胞系，在此之后近20年里，人们相继自早期胚胎建立了仓鼠、猪、兔、水貂、大鼠、鱼类、鸟类、牛等灵长类动物( 恒河猴狨) 和人的类ES细胞系，从PGCs分离克隆到小鼠EG细胞系后，人们分别自PGCs分离克隆到人山羊鸡等类ES细胞[15]。

3.2 胚胎干细胞的体外培养

3.2.1培养基成分

需要特殊的培养液，由于胚胎干细胞来源于分裂增殖的早期胚胎细胞，营养要充足以维持其生长代谢。因此，需要含糖量高营养丰富的高糖型DMEM培养基以提供饲养细胞生长所需要的能量，同时又能提高胚胎干细胞的增殖速度。

3.2.2饲养层细胞

饲养层细胞能向培养液中分泌多种细胞因子提供胚胎干细胞生长的环境和信号，通过细胞接触机制和非接触机制，促进胚胎干细胞增殖并阻止其分化饲养层细胞的来源，可以是人或胚鼠的成纤维细胞。

3.2.3细胞因子

许多细胞因子有促进胚胎干细胞增殖和抑制其分化的作用，需要加入白血病抑制因子抑制分化。

4 胚胎干细胞的鉴定

4.1 形态学鉴定

胚胎干细胞的形态结构与早期胚胎细胞相似，细胞体积小，核质比高，细胞核显著，核