虫草多糖的分离纯化及含量测定

虫草多糖的分离纯化及含量测定

[摘要]目的采用发酵法从冬虫夏草发酵液及菌丝体中提取、分离虫草多糖。方法采用乙醇沉淀法分离冬虫夏草发酵液和菌丝体中的多糖；采用苯酚硫酸法测定样品中多糖含量。结果采用此法进行制备、检测，方法简单快速，结果准确，适宜推广使用。结论此法无需多糖纯品，具有快速简单、精确度高、灵敏度高、重现性较好的优点，是检测虫草多糖含量的较优方法之一。

[关键词]发酵液；虫草多糖；菌丝体虫草多糖；分离纯化；含量测定

[中图分类号] r28???[文献标识码] b???[文章编号] 2095-0616（2012）21-95-02

purification and determination of cordyceps polysaccharide

cui?lixun1??zhang?aihua1??sun?shouying2

1.heilongjiang biotechnology vocational college，harbin 150025，china；

2.heilongjiang new yisheng pharmaceutical co.，ltd，jixi 158200，china

[abstract] objective using the method of inoculated fermentation to extract and separate the cordyceps polysaccharide from the zymotic fluid and mycelium of chinese caterpillar fungus. methods separated the polysaccharide of

chinese caterpillar fungus’ zymotic fluid and mycelium in ethanol precipitation；survey and evaluate the polysaccharide content of samples in phenol-sulfuric acid method. results it is profitable for using widely because of the fast， easy method and exact result for producing and detecting. conclusion this method is one of excellent ways for detecting the cordyceps polysaccharide contents and it doesn’t need the polysaccharide from pure product. the advantages are fast and easy， high accuracy and sensitivity，and good reproducibility.

[key words] fermentation broth；cordyceps polysaccharide；mycelium of cordyceps polysaccharide； separation and purification； content determination

冬虫夏草首载于本草从新，味甘，性温，归肺、肾经，具补肺益肾，止血化痰之功效。冬虫虫草中含量最高的活性物质是虫草多糖，因其可以抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力等功效而受广大人群青睐，由于天然的活性成分来源有限，现多采用人工发酵法生产制备。作者用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。

1?材料

1.1?供试材料

虫草菌株（青海省）；蒸馏水（双蒸水）、发酵液精多糖ⅰ和菌

丝体精多糖ⅱ；葡萄糖标准溶液（100 μg/ml）等。

1.2?仪器及设备

培养箱（常州市恒久仪器制造有限公司光照培养箱）；高压蒸汽灭菌设备（鸡西辰丰医疗器械制造有限公司yxq.l-75型立式压力蒸汽灭菌器）；大容量离心机（北京时代北利离心机有限公司

gtr10-2）；紫外分光光度计（上海悦丰仪器仪表有限公司）等。

1.3?培养基配方

1.3.1?活化培养基（g/ml）?蔗糖溶液1.30%，葡萄糖溶液1.30%，蛋白胨0.01%，酵母粉0.065%，琼脂0.5%，kh2po4 0.025%，mgso4·7h2o 0.012 5%，ph自然，培养温度27℃。

1.3.2?发酵培养基（g/ml）?葡萄糖1.75%，蛋白胨0.02%，酵母粉0.062 5%， kh2po4 0.025%，mgso4·7h2o 0.012 5%， ph自然，温度27℃[1]。

2?方法

2.1?配制培养基和灭菌

按体积向培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节ph值至中性，趁热倒入容器中。高压蒸汽灭菌，温度121.9℃，时间20 min。灭菌完成，趁热倒在平板上。

2.2?活化菌种

在无菌条件下，将冷冻完好的菌种接到培养基上，无光条件下27℃培养，培养菌丝洁白并生长旺盛且无杂菌后备用。

2.3?配制发酵培养基及培养

把培养基上的菌种快速接入到发酵培养基中，在27℃条件下，无光培养192 h。

2.4?发酵液多糖的分离纯化[2]

2.4.1?发酵液及透析袋的处理?发酵液在4 000 r/min条件下离心20 min，过滤得到上清液和沉淀（菌丝体）。将透析袋分成小段后，处理后在4℃条件下存放于冰箱保存待用。

2.4.2?发酵液多糖的提取?醇沉：将无水乙醇以3倍体积加于发酵液中，离心后得上清液，4℃条件静置12 h后，在4 000 r/min 离心15 min，过滤得沉淀，用乙醇洗涤。脱蛋白：用热水将发酵液粗多糖溶解，冷却后反复3次去蛋白。脱色：多糖溶液加1.5%活性碳去色素，透析：将脱色后的虫草多糖溶液装入透析袋中，在蒸馏水中透析24 h，将3倍体积乙醇加于透析后溶液中，在4℃条件下沉淀过夜，离心得沉淀物并干燥，制得发酵液精多糖[3]。

2.4.3?沉淀物的处理?用研钵研碎发酵所制得的菌丝体，加蒸馏水至体积的10倍，水浴加热96～100℃条件下浸提3 h，反复浸提3次并将滤液合并，加入95%乙醇至4倍体积并低温沉淀过夜，离心制得沉淀，然后用乙醇和丙酮各洗涤2次，干燥，得粗多糖。

2.5?发酵液多糖的测定[4]

2.5.1?制作葡萄糖标准曲线?将葡萄糖标准溶液（100 μg/ml）1.0、2.0、

3.0、

4.0、

5.0 ml加入试管中，加蒸馏水至10.0 ml。