变异与诱变育种

诱变育种的操作方法
选择菌种 纯化培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
诱变育种的主要环节
（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株——筛选
一、常见诱变剂
1、诱变剂的种类
①物理诱变剂 射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子 ②化学诱变剂 碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍和甲基 磺酸乙酯等。 化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效，而且很经 济，但大部分诱变剂是致癌剂，危害性大。
⑶温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
2.3 诱变育种的操作方法
选择菌种 同步培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
5、筛选的方法
随机筛选 平皿快速检查 理性化筛选
依靠经验，挑选菌落，测定发酵单位。 平板培养基可直接反应菌种的能力。
从产物形成的生理生化途径着手，进 行有的放矢的筛选。如营养缺陷型菌 株的筛选等，筛选而产生的这些特性， 称为遗传标记。
四、诱变剂及诱变剂量
选择菌种 纯化培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
一）诱变剂种类的选择
1.诱变剂的种类？
2.选何种诱变剂？ （没有定论，参考：菌株的特性，诱变史，或做实 验确定）
二）选择最适诱变剂量
亚热带链霉菌（白霉素）与X射线剂量之间的变异关系
前人的经验
长期诱变高产菌株 遗传性状不稳定的菌株
赭石 火泥棕 海螺橙 淡可可棕
13
0.4
平滑紧密
白
鱼鳃红
6911
§2 诱变育种的步骤与方法
选择菌种 纯化培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
二、菌株的纯化培养（做一次自然选育） 保存的菌种斜面活化培养划线分离（获稀释分 离）挑选优良性状的单菌落 三、菌悬液的制备
目的： （1）细胞均匀分散，能均匀的接触诱变剂 （2）避免以后的筛选的菌落不纯。 方法： （1）细菌菌体：液体培养、震荡打匀、棉花过滤 （2）孢子：液体培养至孢子刚萌发、震荡打匀、 棉花过滤 （3）丝状菌体：取菌丝尖端处菌体进行诱变 （4）制备原生质体：
B、暗修复作用 核酸内切酶切开二聚体 的5’末端,形成3’-OH和 5’-P的单链缺口 核酸外切酶从5’-P到 3’-OH方向切除二聚体 ，并扩大缺口
DNA聚合酶以另一条互 补链为模板，从原有链 上暴露的3’-OH 端起合 成缺失片段
连接酶将新合成链的3’OH与原链的5’-P相连接
紫外线诱变育种中的注意事项
表：灰黄霉素高产菌寻麻青霉D-756诱变 系谱菌株表型变异与产量递增的关系
诱变代数 菌落大小/cm 菌落表面结构 菌落颜色 可溶性色素 效价变化 （%） 100 2011 2642 3547
1 10 11 自然分离
1.3 0.8 0.6 0.5
平滑疏松 平滑紧密 平滑紧密 平滑紧密
龟背灰绿 白 白 白
• 紫外线诱变 (265nm)，搅拌；避光，提前 20min预热紫外灯。结束时冰浴1-2h。
(2)化学诱变剂
• 烷化剂（硫酸二乙酯，芥氮等）——与碱基发生化学反应，导 致DNA复制时错配。 • 碱基类似物（5-溴尿嘧啶等）——DNA复制时代替碱基参与 DNA复制，造成复制错误。 • 移码突变诱变剂（吖啶类染料）——诱变剂分子能插入相邻的 DNA碱基对之间，引起移码突变。 • 脱氨剂（亚硝酸）——引起嘌呤和嘧啶上的氨基变成酮基，引 起DNA复制时的错配。
红 花 的 后 代 变 了 蓝 紫 色
蓝 紫 色 花 后 代 仍 是 蓝 紫 色
第六章 人工诱变育种
原理：人工诱变菌种使其增加基因 突变的频率，从而更多机会筛选得 到优良的子代菌种。 优点： 1 能大幅度地提高产品的产量和 质量 2 突变频率比较大 缺点： 1 疲劳效应，指某一菌株长期使 用诱变剂处理之后，会对诱变剂不 再敏感 2 会引起菌种生长周期的延长、 孢子量减少和代谢减慢等 3 仍有一定的盲目性
2、诱变剂的作用原理
(1)物理诱变剂
• 紫外线——引起DNA上相近的两个胸腺嘧啶成为二聚体。
(2)化学诱变剂
• 烷化剂（硫酸二乙酯，芥氮等）——与碱基发生化学反应，导 致DNA复制时错配。 • 碱基类似物（5-溴尿嘧啶等）——DNA复制时代替碱基参与DNA 复制，造成复制错误。 • 移码突变诱变剂（吖啶类染料）——诱变剂分子能插入相邻的 DNA碱基对之间，引起移码突变。 • 脱氨剂（亚硝酸）——引起嘌呤和嘧啶上的氨基变成酮基，引 起DNA复制时的错配。
光复活机理：经紫外线照射所形成的带有胸腺嘧
啶二聚体的DNA分子，在黑暗中与光激活酶结合， 形成的复合物暴露在可见光（300~500nm）下时， 此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重 新分解成单体。
PRE为光复活酶
由于光复活作用，所以在进 行紫外线诱变育种时，应避光 （或在红光下）进行照射及处 理照射后的菌液。
§2 诱变育种的步骤与方法
选择菌种 纯化培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
一、出发菌株的选择 1 要具备一定生产能力或某种特性的菌株。 也就是说出发菌株应该对目的产物有一定的生产能力， 至少能少量产生这种物质。 2 选择纯种作为出发菌株 3 选择遗传性状比较稳定的菌株 4 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株？ 由于产量变异是数量遗传，只能逐步累加，一次大幅度 提高发酵水平不太容易。在选择出发菌株时，应挑选每 代诱变处理后均有一些表型改变的菌株。 微生物中还存在一类“增变菌株”。
3 培养条件和环境条件 ⑴前培养（诱变前预培养）
前培养一般加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黄、b-重氮尿嘧啶、 嘌呤等物质，能显著提高突变率。若加入氯霉素、胱氨酸等还原性 物质，会使突变率下降。
⑵后培养
后培养一般加入酪素水解物、酵母膏等富含氨基酸、生长因子、 ATP等，有利于突变体重新调节代谢。
资料1：在北京培育的优质甘蓝品种，叶球最大的有3.5KG，当引种到拉 萨后，由于昼夜温差大、日照时间长、光照强，叶球可重达7KG左右。 但再引回北京后，叶球又只有3.5KG。为什么会这样呢？
拉萨 甘蓝
北京
3.5kg
7kg
3.5kg
资料2：在种植花卉时，发现红花的后代出现了蓝紫花，蓝紫色花的后 代仍是蓝紫色。这种现象是哪类变异呢？
3、常见诱变剂的诱变原理及使用方法
1）紫外线
(1)、紫外线的有效光谱（40~390nm）
能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是 200～300nm，最有效的波长为260~265nm。 (2)、紫外线的用量（相对剂量：用致死率表示） 15W紫外灯、30cm灯距、杀菌率90％－99.9％时不同微生 物的照射时间： 一般芽孢：10min 一般微生物营养体：3－5min
低剂量 较缓和的诱变剂、低剂量
Baidu Nhomakorabea
诱变史短的野生型菌株
多核的细胞菌株
先用较高剂量，然后用较缓 和的诱变剂、低剂量
较高剂量
五、影响突变率的因素 1 菌种遗传特性
（有的诱变剂只作用于DNA复制期，有的可作用于各期细胞）
2 菌体细胞壁结构
（有的菌种孢子壁厚、有保护层、均减弱诱变剂的作用效果）
诱变育种的操作方法
选择菌种 纯化培养 细胞悬液 诱变处理 筛选变异菌株
§1 诱变育种前的准备
1、了解菌种特性（生长情况、菌落类型，最佳培养条件， 有效产物合成的最佳条件） 2、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法。 3、确定菌种保藏的方法。 4、制定好整个诱变育种实验的实施计划，包括实验的时 间安排，每天的工作计划，耗材购买计划，人员的安排。
无芽孢菌和革兰氏阴性菌：0.5－2min
（3）紫外线的诱变机制 紫外线的诱变作用 机制主要是引起 DNA链上相邻的嘧 啶形成二聚体。导 致复制时不能正常 配对。
嘧啶的紫外线光化产物
（4）诱变后细胞的修复
A、光复活作用——把经紫外线照射后的微生物立 即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现 象，称为光复活作用。
菌悬液的制备要求 1 在细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数 期，这样突变率高，重现性也好。对细菌来说，常常通过 前培养达到要求。
菌悬液的制备要求 2 菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子，不但能 均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象。
3 菌悬液的浓度，要求霉菌孢子约为106个/mL，放线菌 孢子约为106~107个/mL。