中性蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米蛋白水解作用的研究

１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂 玉米蛋白粉：玉米打浆、过滤，去掉粗纤维部
分，脱水，烘干，磨碎，待用。 中性蛋白酶、碱性蛋白酶 广西南宁庞博生物工程
有限公司；氢氧化钠、甲醛、柠檬酸、盐酸、硼酸、 浓硫酸、甲基红 － 溴甲酚绿、硫酸铜、硫酸钾等。 １．２ 仪器与设备
ＺＤ－２ 自动电位滴定仪 上海雷磁仪器厂；７６－１ 型 恒温玻璃水浴电动搅拌机 上海标本模型厂；ＨＨ－２ 型 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；八孔消化炉 上 海纤检仪器有限公司；凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限 公司；ＬＤ５－１０ 低速离心机 北京医用离心机厂。 １．３ 方法
※基础研究
食品科学
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法）；蛋白质测定：微量凯氏定氮法；氨基酸态氮的测 定：甲醛电位滴定法；水解程度（ Ｄ Ｈ ）的测定：Ｄ Ｈ ＝ （游 离氨基氮 ／ 总氮）× １００％；蛋白质溶出率测定：蛋白质 溶出率（％）＝（水解液中总氮×水解液体积－加酶质量）／（原 料中总氮×原料克数）× １００％。
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｎ Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＨＥ Ｌｉ－ｐｉｎｇ，ＬＩＵ Ｌｉａｎｇ－ｚｈｏｎｇ＊ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００２３， Ｃｈｉｎａ）
ＤＨ（％）
１３ １２ １１ １０ ９ ８ ７ ６ ５ ４
３０
中性蛋白酶对水解度的影响 碱性蛋白酶对水解度的影响
４０
５０
６０
７０
温度（℃）
图 １ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别在不同作用温度下的水解度 Fig.1 Degree of hydrolysis of neutrase or alkaline protease at
０．４０
０．３５
氨基酸态氮含量（％）
０．３０
０．２５
０．２０
０．１５
０．１０
中性蛋白酶对氨基态氮含量的影响
０．０５
碱性蛋白酶对氨基态氮含量的影响
０．００
２０
３０ ４０ ５０
６０
７０
温度（℃）
图 ３ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别在不同作用温度下 水解玉米蛋白的氨基氮含量
Fig.3
Amino nitrogen contents of neutrase and alkaline protease hydrolysis at different temperatures
从图 ３ 可以看出，中性蛋白酶和碱性蛋白酶在 ５５℃ 时的氨基酸态氮含量最高。中性蛋白酶水解随温度的升 高其氨基酸态氮的含量变化不大；碱性蛋白酶水解随温 度的升高变化很大，在 ５５℃时氨基酸态氮的含量明显增 大。这说明，５ ５ ℃是中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解的 较佳温度。
（１）不同温度对单一酶水解效果的影响 将玉米蛋白粉用水配成 １０％ 的悬液，调整中性蛋白 酶的处理液 ｐＨ 均为 ７．０、碱性蛋白酶的处理液 ｐＨ 均为 ８．０（使其在酶解过程中保持稳定），中性蛋白酶加酶量为 ７０８８Ｕ／ｇ，碱性蛋白酶加酶量为 １６８０Ｕ／ｇ，在不同温度 （３５、４５、５５、６５℃）下恒温 ２ｈ 后，灭酶（１００℃，１０ｍｉｎ）， 离心（３５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），测定不同酶解温度下所得样 品的水解度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量。 （２）不同酶用量对单一酶水解效果的影响 将玉米蛋白粉用水调配成 １０％ 的悬液，ｐＨ 调节与 ａ 相同，中性蛋白酶加酶量为 １ ７ ７ ２ 、３ ５ ４ ４ 、７ ０ ８ ８ 、 １０６３２Ｕ／ｇ；碱性蛋白酶加酶量为 ４ ２ ０、８４０ 、１６８０ 、 ２５２０Ｕ／ｇ，在 ５５℃条件下恒温 ２ｈ 后，灭酶（１００℃， １０ｍｉｎ），离心（３５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），测定不同酶解温 度下所得样品的水解度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮 含量。 （３）不同 ｐＨ 对单一酶水解效果的影响 将玉米蛋白粉用水调配成 １０％ 的悬液，调整中性蛋 白酶处理液的 ｐＨ 分别为：５．５、６．０、６．５、７．０、７．５； 碱性蛋白酶处理液的 ｐＨ 分别为：７．０、７．５、８．０、８．５、 ９ ． ０ ，并使其在酶解过程中保持稳定。分别加入中性蛋 白酶或碱性蛋白酶，中性蛋白酶的加酶量为 ３５４４Ｕ／ｇ， 碱性蛋白酶的加酶量为 ８４０Ｕ／ｇ，在 ５５℃条件下恒温 ２ｈ 后，灭酶（１００℃，１０ｍｉｎ），离心（３５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）， 测定不同酶解温度下所得样品的水解度、蛋白质溶出率 和氨基酸态氮含量。 （４）不同水解时间对单一酶水解效果的影响 将玉米蛋白粉用水调配成 １ ０ ％ 的悬液，ｐＨ 调节与 （１）相同，分别加入中性蛋白酶或碱性蛋白酶，中性蛋白 酶的加酶量为 ３５４４Ｕ／ｇ，碱性蛋白酶的加酶量为 ８４０Ｕ／ｇ， 在 ５５℃条件下每小时取样 １ 次，灭酶（１００℃，１０ｍｉｎ）， 离心（３５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），测定不同酶解时间下所得样 品的水解度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量。
different temperatures
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食品科学
※基础研究
从图 １ 和图 ２ 看出，在 ５ ５ ℃时，中性蛋白酶和碱 性蛋白酶作用后水解液的水解度是最高的，高于此温度 或低于此温度时水解度明显偏小。因此，所用中性蛋 白酶和碱性蛋白酶单一酶水解的较适温度为 ５ ５ ℃。另 外，在以上条件下，中性蛋白酶水解度明显比碱性蛋 白酶水解度大，且中性蛋白酶随温度的增大其水解度变 化不大。而采用碱性蛋白酶水解的水解液的蛋白质溶出 率比中性蛋白酶的高。５ ５ ℃时，中性蛋白酶和碱性蛋 白酶的蛋白质溶出率与其他温度下的蛋白质溶出率高。 由图 １ 和 ２ 可见，温度对碱性蛋白酶的水解度和蛋白质 溶出率的影响较大。
１．３．１ 测定方法 中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力测定：Ｆｏｌｉｎ 法（第一
收稿日期：２００７－０３－２１ 作者简介：何莉萍（ １ ９ ８ ３ － ） ，女，硕士研究生，研究方向为食品新资源开发。Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ：ｈ ｅ ｌ ｉ ｐ ｉ ｎ ｇ ７ ４ ５ ＠ １ ２ ６ ． ｃ ｏ ｍ ＊ 通讯作者：刘良忠（１９６３－），男，教授，博士，研究方向为功能食品与农产品深加工。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕ２０２２８８８＠１６３．ｃｏｍ
在玉米淀粉和玉米汁等产品的加工过程中，产生部 分不溶于水的物质，其成分包含蛋白质、纤维素等。由 于玉米蛋白水溶性差，成为加工中的下脚料，目前，这 些下脚料没有得到有效的利用。采用现代生物技术水解 下脚料中的玉米蛋白，加工成玉米蛋白肽，则能有效的 提高下脚料中蛋白质的利用率。研究表明，采用酶水解 技术水解动植物蛋白质加工成的蛋白肽具有良好的功能特 性：如能改善肝性脑病症状，降低血清胆固醇［ ４ ］ ，及抗 疲劳、解除乙醇毒性［ ５ ］ 等的功能作用。本研究探讨中性 蛋白酶和碱性蛋白酶分别作用和共同作用对玉米蛋白粉 中玉米蛋白的水解效果。
１．３．２ 蛋白酶水解工艺及水解指标的确定
１．３．２．１ 中性蛋白酶、碱性蛋白酶单一酶水解最佳酶 解条件的确定
采用中性蛋白酶或碱性蛋白酶在不同 ｐ Ｈ 、温度、 时间、酶浓度、底物浓度条件下对玉米蛋白粉中的玉 米蛋白进行水解，水解后的酶解液经离心和分离后，测 定其水解度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量。
different temperatures
４５
中性蛋白酶对
４０
蛋白质溶出率
３５
的影响
碱性蛋白酶对
３０
蛋白质溶出率
２５
的影响
பைடு நூலகம்
蛋白质溶出率（％）
２０
１５
１０ ２０
３０ ４０ ５０
６０ ７０
温度（℃）
图 ２ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别在不同作用温度的蛋白质溶出率 Fig.2 Protein utilization rate of neutrase or alkaline protease at
１．３．２．２ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶水解对水解 度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量的影响
将玉米蛋白粉用水调配成 １０％ 的悬液，调节 ｐＨ７．０， 并使其在酶解过程中保持稳定，加酶量为 ３５４４Ｕ／ｇ 的中 性蛋白酶，５５℃条件下每小时取样 １ 次，１００℃，１０ｍｉｎ 灭酶，然后将用中性蛋白酶水解的水解液冷却至室温， 调节 ｐＨ 均为 ８．０，加入酶量为 ８４０Ｕ／ｇ 的碱性蛋白酶， 并使其 ｐＨ 在酶解过程中保持稳定，５５ ℃条件下每小时 取样 １ 次，灭酶后离心，测定不同酶解条件下样品的水 解度、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量。
２ 结果与分析
２．１ 玉米蛋白粉中粗蛋白含量的分析结果 用凯氏定氮法测定玉米蛋白粉中的蛋白含量为
５２．３８％。 ２．２ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶活的测定
中性蛋白酶酶活为 ４４．３０ 万 Ｕ／ｇ；碱性蛋白酶酶活为 １０．５０ 万 Ｕ／ｇ。 ２．３ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解工艺条件的确定
２．３．１ 不同温度对单一酶水解效果的影响
１２．０
１１．５
１１．０
ＤＨ（％）
１０．５
１０．０
中性蛋白酶对
９．５
水解度的影响
碱性蛋白酶对
９．０
水解度的影响
８．５
８．０ ０
２７５０ ５５００ ８２５０ １１０００
［Ｅ］（Ｕ／ｇ）
图 ４ 中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别在不同酶浓度下 水解玉米蛋白的水解度
Fig.4 Degree of hydrolysis of neutrase and alkaline protease with different [E]s
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食品科学
※基础研究
中性蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米蛋白 水解作用的研究
何莉萍，刘良忠 ＊
（武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北 武汉 ４３００２３）
摘 要：本实验研究了中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别作用和共同作用对玉米蛋白粉中玉米蛋白的水解效果。结果 表明，中性蛋白酶水解玉米蛋白的较佳水解条件是：酶浓度 ３５４４Ｕ／ｇ 、ｐＨ７．０ 、温度 ５ ５ ℃、水解时间（ｔ） 为 ２ ｈ ； 碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉的较佳水解条件是：酶浓度 ８ ４ ０ Ｕ ／ ｇ 、ｐ Ｈ ８ ． ０ 、温度 ５５ ℃、水解时间 ２ ｈ 。采用中性蛋 白酶和碱性蛋白酶复合水解玉米蛋白比单一酶水解的效果好，水解液的水解度达到 ２ ０ ％ 以上。 关键词：玉米蛋白；酶；水解
玉米是三大粮食作物之一，目前我国的玉米总产量 居世界第二位，占我国粮食总产量的 ２５％［１］。玉米含有 约 ８ ％ ～１ ４ ％ 的蛋白质，其中 ７ ５ ％ 在胚乳中，２ ０ ％ 在胚 芽中。玉米的蛋白质可分为四种：白蛋白、球蛋白、 醇溶蛋白和谷蛋白，其中醇溶蛋白和谷蛋白分别占 ４０％ 左右，而球蛋白只有 ８ ％ ～９ ％ ［ ２ ］ 。
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｎ ｃｏｒｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ： ［Ｅ］ ３５４４ Ｕ／ｇ， ｐＨ ７．０， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５５ ℃ ａｎｄ ｔｉｍｅ（ｔ） ２ ｈ； Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ： ［Ｅ］ ８４０ Ｕ／ｇ， ｐＨ ８．０， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５５ ℃ ａｎｄ ｔｉｍｅ ２ ｈ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｗｏ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｃｏｒｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ， ａｎｄ ｉｔｓ ＤＨ ｃａｎ ａｃｈｉｅｖｅ ａｂｏｖｅ ２０％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｒｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｗｅｒ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ 中图分类号：ＴＳ２０９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０３－０１５２－０６