敲除小鼠常见问题与回答
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO ）/敲入（KI ）基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换（即同源重组）。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
基因敲除小鼠介绍
基因敲除小鼠介绍展开全文持续活化的Cre敲除基因的效率较高，但敲除基因的时间点不可控，导致基因敲除可能发生在发育早期或非预期的实验时间窗。
诱导型CreER虽具有时间可控性，提高了遗传操作的精确度，但敲除基因效率较低。
为了提高诱导型CreER的基因敲除效率，需要高剂量且多次给予tamoxifen诱导，这不仅对实验小鼠有毒副作用、长期影响其健康状况，而且会引起基因敲除以外的一些混淆的表型。
Cre小鼠通常不需要纯合小鼠，通常杂合子的Cre小鼠表达量已经足够重组了。
纯合子Cre插入位点不确定，可能导致非预期表型。
Cre 小鼠可能带有毒性，对内源基因表达有影响。
Cre小鼠作用的时间点是不可控的，其剪切效率比Cre ER高。
CreER会有leaky(泄露)的情况。
CreER的结果直接取决于tamoxifen诱导时间窗口的基因表达的情况，他莫昔芬可以在胚胎期给药，可以穿过胎盘屏障。
当然也有一种和谐的解决方法：例如2020年周斌组发表的Generation of a self-cleaved inducible Cre recombinase for efficient temporal genetic manipulation文章。
该研究构建了一种新的诱导型Cre重组酶，可通过自我剪切将诱导型CreER转变成持续活化的Cre，实现时间可控的高效遗传操作。
这种新型Cre重组酶结合了诱导型CreER和持续活化的Cre重组酶的优点，既提高了重组效率又具有时间可控性，弥补了传统CreER和Cre重组酶介导的遗传操作技术的缺陷，突破了长期阻碍基因功能研究的瓶颈，可广泛应用于器官发育、组织再生和疾病进程中的基因功能研究。
生殖系统漏表达现象他莫昔芬的给药时间窗口，6-8天才会代谢，连续给药比较好雌激素诱导型 Cre-ER将雌激素受体（estrogen receptor，简称ER）的配体结合区与Cre 重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
●CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）●CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠●CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre 重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。
今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
apoe敲除小鼠如何敲除？
apoe敲除小鼠如何敲除？
ApoE -/-小鼠是目前最常用的一种转基因小鼠品系[2]。
作为一种自发的动脉粥样硬化模型，其与人的动脉粥样硬化进程最为相似。
ApoE是极低密度脂蛋白(VLDL) 和高密度脂蛋白(HDL) 的组成部分，参与胆固醇的运输。
和人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白（LDL）含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。
敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。
研究表明ApoE -/-小鼠可自发形成高胆固醇血症（300-500 mg/dL），并在正常饮食条件下发生显著的动脉粥样硬化病变。
而高脂肪/高胆固醇的致动脉粥样硬化饮食会使血浆胆固醇水平升高超过1000 mg/dL，加速动脉粥样硬化进程[3]。
ApoE -/-小鼠血浆中三酰甘油水平也比正常小鼠高68%，且不受年龄和性别影响，其高密度脂蛋白只有正常小鼠45%[4]。
此类小鼠的病变部位主要发生于主动脉根部、主动脉弓、无名动脉、主动脉分支及肾动脉分叉。
正常饮食条件下，早期泡沫细胞病变可在10周内发生。
15周后发展成动脉粥样硬化病变。
20周后演变成晚期纤维病变。
高脂肪/高胆固醇饮食可加速这一致病过程，包括促进胆固醇结晶、坏死核心和钙化的形成。
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除小鼠
基因敲除小鼠摘要基因敲除小鼠是一种常用的实验动物模型，可以帮助科学家研究基因在生物体发育和功能中的作用。
本文将介绍基因敲除小鼠的定义、用途以及常用的敲除方法，帮助读者了解基因敲除小鼠在生物学研究中的重要性和应用。
引言基因敲除小鼠是指通过干扰或删除特定基因，使小鼠体内该基因表达受到抑制或消失的实验模型。
这种模型被广泛应用于基因功能研究、疾病机制研究以及药物开发等领域。
基因敲除方法基因敲除小鼠的制备有多种方法，其中最常用的是胚胎干细胞敲除和CRISPR/Cas9系统。
胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是一种传统的基因敲除方法。
首先，从小鼠胚胎中获得胚胎干细胞，然后通过基因转染或基因突变等方式，使目标基因发生敲除突变。
最后，将敲除的胚胎干细胞注入到早期小鼠胚胎中，形成敲除小鼠。
CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，已经在基因敲除小鼠制备中得到广泛应用。
该系统利用Cas9核酸酶和特定的引导RNA来定向切割目标基因的DNA链，从而导致基因发生敲除或突变。
基因敲除小鼠的应用基因敲除小鼠在生物学研究中有着广泛的应用，以下是其中几个重要的应用领域：基因功能研究通过敲除特定基因，科学家可以观察与该基因相关的表型变化，从而揭示该基因在生物体发育和功能中的作用。
这对于揭示基因调控网络、疾病机制的研究具有重要意义。
疾病模型研究基因敲除小鼠常被用来构建各种疾病模型，如癌症、心血管疾病等。
这些模型可以模拟人类疾病的发生和发展过程，为相关疾病的研究提供了有力的工具。
药物开发基因敲除小鼠在药物开发中也起着重要的作用。
通过敲除特定基因可以观察药物对目标基因的影响，从而评估药物的疗效和安全性。
结论基因敲除小鼠是一种重要的实验动物模型，被广泛应用于基因功能研究、疾病模型研究以及药物开发等领域。
不同的敲除方法可根据具体实验需求选择使用。
基因敲除小鼠在解析基因功能、揭示疾病机制和评估药物疗效方面发挥着重要的作用，为生物学研究提供了强大的工具。
基因敲除：我的老鼠只有我懂
基因敲除：我的老鼠只有我懂作者：遥遥（转载请注：解螺旋·医生科研助手）如果是在做动物实验，而且是基因敲除鼠的实验，那么就会做大批量的小鼠基因型鉴定试验，来确定自己小鼠的基因型，然而，再做实验的过程中往往会出现一些意想不到的结果，我作为一只实验狗在这里为大家提一点点小建议。
提取DNA1、组织提取DNA 剪下老鼠0.5-1.2cm尾巴或者耳朵或者称取20mg组织样本，将样本剪碎放在1.5ml的EP管中。
2、在每个EP管中加入275微升的裂解液（我们实验室使用的是promega的试剂盒）将加入裂解液的组织放在55摄氏度的水浴箱中过夜（16—18h）裂解完全的标志是组织完全溶解。
3、第二天振荡每一个EP管，混匀后再离心，转速13000rmp时间是3分钟，取上清分离毛发，将取的上清加到柱型管中（有滤网的小柱型管，柱型管套装在1.5的EP管中）。
4、在每个柱型管中加入250微升的Wizard SV lysis Buffer，此裂解液需要提前水浴30min，55摄氏度。
5、离心3min 转速13000rpm ，倒掉滤液。
6、在每个管中加入650微升wash solution 离心1min转速13000rpm，这一步骤重复四遍，每一次都弃去管底的废液。
7、4次洗完之后，什么都不加再离心一次，1min 转速13000rmp。
8、离心之后取出，放入到新的EP管中，每一个EP管中加入50微升Nuclease-free-water（无核酸酶水）需要提前水浴30min中55摄氏度。
加的过程中要充分覆盖管底，静置2min，离心2min，保留EP 管中的液体，此步骤重复两次。
（如果要搁置需要保存在-20冰箱中）。
自此DNA已经提取完成。
显影1、将获得的液体加入PCR混合液中，凝胶电泳，鉴定基因型。
PCR混合液的配制方法ddH2O 9.5微升，Taq12.5微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升。
每一个EP管中的总量是24微升，提取的DNA 只加1微升。
基因敲除小鼠鉴定 解读
基因敲除小鼠鉴定解读基因敲除小鼠鉴定解读，这事儿就像一场神秘的探索之旅。
咱们先得知道啥是基因敲除小鼠。
简单来说，就好比是在小鼠这个小世界里，我们用特殊的手段把某个基因像拆除小零件一样给去掉了。
这时候的小鼠就成了研究这个基因功能的绝佳模型。
那怎么知道这个基因是不是真的被敲除了呢？这就需要鉴定啦。
鉴定基因敲除小鼠，就像检查一件精心打造的艺术品有没有瑕疵。
一种常见的方法是通过基因测序。
这就像是给小鼠的基因密码本进行逐字逐句的校对。
测序的结果就像是一把钥匙，如果发现原本应该存在的基因片段不见了，那很可能这个基因就被成功敲除了。
不过，这可不是唯一的办法哦。
还有一种办法叫PCR检测。
这PCR检测呀，就像是一场基因的放大镜游戏。
我们通过特定的引物，就像是专门寻找特定宝藏的小钩子，去钓出我们感兴趣的基因片段。
如果在基因敲除小鼠里钓不到这个片段，而在正常小鼠里能钓到，那这也是基因敲除成功的一个标志。
这感觉是不是有点像寻宝呢？那鉴定出来之后，又怎么解读这些结果呢？这可就更有趣了。
如果确定基因敲除成功了，就像是我们找到了打开一扇神秘大门的钥匙。
这个时候，我们就能观察小鼠的各种表现了。
比如说，要是敲除的是一个和毛发颜色有关的基因，那小鼠的毛发颜色可能就会变得很奇怪。
这就像一幅画里原本该是红色的花朵，我们把负责红色的颜料给拿走了，那花朵就不是红色的了。
从行为上也能看出很多东西。
假如敲除的基因和小鼠的运动能力有关，那这只基因敲除小鼠可能就会比正常小鼠跑得慢或者动作不协调。
这就好比一辆汽车，如果我们拆掉了发动机里的某个关键零件，汽车肯定就跑不起来或者跑得歪歪扭扭的。
但是呢，解读结果也不是那么简单的事儿。
有时候可能会出现一些假象。
就像我们在雾里看花一样，看起来好像基因被敲除了，但实际上可能还有一些残留的基因功能在悄悄发挥作用。
这时候就需要我们更加仔细地去分析。
比如说，小鼠的某个表型变化可能不仅仅是因为这个基因被敲除了，还可能受到其他因素的影响。
基因敲除技术试题2则
基因敲除技术试题2则1．曾有科学家用“基因敲除”的方法生成嵌合体小鼠。
具体过程是将外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA 序列中，使某一个基因被取代或破坏而失活，形成杂合体细胞，然后将其植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。
请回答下列问题；（1）将外源基因整合到小鼠细胞的DNA序列中__________（填“属于”或“不属于”）基因突变。
（2）在基因敲除过程中要用到的酶有______________、______________等。
（3）要检测外源基因是否整合到小鼠胚胎干细胞的DNA序列中，常用的方法是______________________。
（4）嵌合体小鼠的生成涉及到的生物工程技术有______、______、______等。
（5）基因敲除技术有利于人类对某些遗传因素引发的疾病进行研究，下列疾病中，可能利用基因敲除技术治疗的有______。
A．囊性纤维病B．21三体综合征C．猫叫综合征D．镰刀型细胞贫血症2．基因剔除动物模型一直以来是开展基因功能研究的重要工具，其原理是通过导入外源分子使动物的某特定基因失活，进而培养出有基因缺陷的动物来研究相应基因的功能。
下图是制作某类基因剔除小鼠流程示意图。
请据图回答相关问题：（1）图中①过程常用的技术是______，②过程是______。
（2）体外受精时需要对精子进行______处理，然后与处于______期的卵母细胞在专用的受精溶液中完成受精过程。
（3）为更多地获得基因剔除小鼠，可对囊胚阶段的胚胎进行分割移植，此时要对______进行均等分割。
请说明理由：__________________________________________________________________________。
（4）研究发现人的SP1基因与乳腺癌细胞的异常表达和增殖密切相关。
你认为基因剔除技术可以为乳腺癌的治疗提供怎样的新思路：_______________________________________________________________。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
基因敲除小鼠饲养繁殖技巧
基因敲除⼩⿏饲养繁殖技巧科研狗但凡要做动物实验的，哪个不需要伺候⼩⿏？每天好吃的好喝地伺候着，定期更换垫料，还要操⼼它们的⼈⽣⼤事，给它分配对象，⽣了娃还要给帮它们做“亲⼦鉴定”，看见⼩⿏脱发了，要想办法，母⿏不⽣了，要想办法。
回头再看看⾃⼰，没头发，还没对象，天天愁⽂章，担⼼毕不了业，全指望⼩⿏们加油，让⾃⼰早⽇出成果，所以可不得好吃好喝的伺候它们嘛！尤其是基因敲除⼩⿏，⾝价昂贵，从接到它的那⼀刻起，整个⼈都⼜兴奋⼜紧张，⽣怕怠慢了这些⼩家伙，那么收到基因敲除⼩⿏后要如何制定计划进⾏扩群繁殖以满⾜实验需要呢？除了了解所选品系的⽣活习性外，我们还要考虑⾃⼰需要的基因编辑⿏可能出现哪些问题，有没有解决或者是改善的⽅法，这些我们可以通过查阅⽂献看有没有关于该基因敲除⼩⿏的相关信息并作出⼀个初步判断。
1.背景品系的特点这个不⽤多说，需要做动物实验的同学，谁还没养过⼏只⼩⿏呀，养之前肯定已经把它的⽣活习性、繁殖特点、饲养要求等了解的很清楚了，举个栗⼦，⽐如说C57BL/6J,该品系的雄⿏好⽃，尤其是刚断奶后不同窝的雄⿏不宜放⼀笼饲养。
2.饲养环境的要求应尽可能地给⼩⿏提供适宜的⽣活环境和营养，这⽅⾯可以参照国家标准来进⾏饲养管理。
⽐如，⼩⿏对于噪⾳、光照⽐较敏感，所以我们应给⼩⿏提供安静的环境，尽量选在⼈员⾛动少的地⽅，也不要频繁查看⼩⿏情况，这样⼩⿏会有压⼒的。
母⿏有筑巢的天性，可以向笼中放柔软的棉垫，⿎励其筑巢，有助于提⾼产量。
3.基因敲除⼩⿏饲养管理应注意哪些问题⼤多数基因敲除⼩⿏相对野⽣型⼩⿏⽽⾔，在某些⽅⾯会存在或⼤或⼩的问题，所以我们需要查阅相关的⽂献，看看有没有该基因敲除⼩⿏的⽂献报道，该基因被修饰后会出现哪些问题？这些问题有没有解决或者是改善的⽅法。
如果是某种基因被修饰后会导致⼩⿏不能合成某种物质，那么可以给⼩⿏额外补充该物质；若是基因敲除⼩⿏的成活率低，问题有可能出现在着床期⾄成年期的任意时间段，通过代乳和改善饲养条件也许能得以解决；如果基因敲除⼩⿏的⽣殖⼒低。
【干货】基因敲除小鼠鉴定方法
【⼲货】基因敲除⼩⿏鉴定⽅法
1、基因敲除阳性⿏的鉴定
在敲除的⽚段两端设计引物，扩增后电泳。
理论上敲除成功的⼩⿏扩增出的⽚段⼤⼩=野⽣型⼩⿏的⽚段⼤⼩－敲除的⽚段⼤⼩，所以可通过电泳图的条带⼤⼩来进⾏鉴别，但实际上，若敲除的⽚段过⼤，有的酶是扩增不出来野⽣型⽚段的，⽐如有的酶，1.5K以下基本可以P出条带，⼤于1.5K的⼤部分是P不出的，所以当野⽣型的条带⽆法扩增时，这对引物就不能鉴定纯杂合了。
PCR鉴定⽆阳性，都是⼩⿏的错？
1.1、野⽣型⽚段扩增不出来时
敲除的⽚段较⼤时，野⽣型相应的⽚段往往扩增不出来。
电泳结果若是⽆条带，则为野⽣型；若是只有⼀条条带，则为敲除⼩⿏（纯合或杂合）。
PS:条带⼤⼩=野⽣型⽚段⼤⼩-敲除⽚段⼤⼩
PCR鉴定⽆阳性，都是⼩⿏的错？
1.2、野⽣型⽚段可以扩增出来时
假设
条带1⼤⼩=野⽣型条带⼤⼩
条带2⼤⼩=野⽣型⽚段⼤⼩-敲除⽚段⼤⼩
当野⽣型的⽚段可以扩增出来时，电泳结果若是只有条带1，则为野⽣型；若是既有条带1⼜有条带2，则为杂合敲除⼩⿏；若是只有条带2，则为纯合敲除⼩⿏。
所以这种情况就不需要再设计引物鉴定纯杂合了。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法基因敲除小鼠模型是生物医学研究领域中常用的实验动物模型之一。
通过对特定基因进行敲除，科研人员可以研究该基因在生物体内的功能和影响，从而深入了解该基因对生物体的生理和病理过程的调控作用，为人类疾病治疗和药物研发提供重要的实验基础。
下面我们将介绍关于基因敲除小鼠的方法。
一、基因敲除小鼠的原理和意义1.1 基因敲除原理基因敲除是指通过人工手段破坏特定基因的DNA序列，使其失去功能。
在小鼠模型中，通常利用基因敲除技术将目标基因进行突变或删除，从而观察小鼠在不同生理状态下的表型变化，探索目标基因在生物体内的功能和作用机制。
1.2 基因敲除的意义基因敲除小鼠模型可以帮助科研人员研究特定基因的生物学功能，了解其在生物体内的作用机制。
基因敲除小鼠模型也能够为疾病研究和药物开发提供重要的实验依据，有助于发现新的治疗靶点和疾病治疗方法。
二、基因敲除小鼠的制备方法2.1 基因敲除小鼠的选择在进行基因敲除小鼠实验前，首先需要选择合适的小鼠品系和基因靶向。
常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c等，而基因敲除的选择通常基于目标基因在疾病或生理过程中的重要性。
2.2 敲除载体的构建和筛选制备基因敲除小鼠需要先构建敲除载体，通常采用基因工程技术将靶向基因进行突变或删除，然后将这些构建好的载体导入至小鼠胚胎干细胞中，进行筛选和培养。
2.3 胚胎干细胞的培养与筛选在培养和筛选过程中，科研人员需要将导入敲除载体的胚胎干细胞引入小鼠胚胎中，然后进行体外培养和筛选，以筛选出正常的敲除基因小鼠。
2.4 敲除小鼠的鉴定和繁殖成功培育出的敲除小鼠需要进行PCR鉴定和繁殖，以得到稳定传代的敲除小鼠品系。
对敲除小鼠进行系统的表型观察和分析，以确定目标基因敲除后的表型变化。
三、基因敲除小鼠的应用和前景3.1 基因敲除小鼠在生物学研究中的应用基因敲除小鼠模型广泛应用于生物学研究领域，包括生理学、免疫学、神经科学、遗传学等各个领域。
用了条件性基因敲除小鼠就能发高分文章？首先你得跨过这些坑
用了条件性基因敲除小鼠就能发高分文章？首先你得跨过这些坑在学习跨坑之前，先来了解一下条件性基因敲除小鼠真身。
条件性基因敲除 CKO条件性基因敲除（Conditional Knockout）是指将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段，实现对小鼠基因组的时空特异性修饰。
应用•胚胎致死性基因的研究•研究靶基因在特定组织或细胞中的功能•研究靶基因在特定时期或阶段发挥的作用优势•多功能的基因敲除模型，可与不同工具鼠灵活搭配使用•明确了目的基因缺失的细胞类型或缺失发生的特定时间，更加客观而系统地研究目的基因在不同组织器官发生、发育或疾病发生、治疗过程中的作用与机制•克服了重要基因完全敲除后的胚胎致死或过早死亡，研究表明约有 1/3 的基因纯合敲除后会导致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡•避免由于全身性敲除目的基因可能引发的其它基因的代偿，导致基因敲除后没有明显表型改变为什么拥有条件性基因敲除小鼠模型更容易发高分文章？一篇好文章，意味着我们需要一个好故事。
时间、地点、人物，这故事的三大基本要素自然是缺一不可！简单的来说，故事的主人公就是我们所研究的基因。
而 CKO 除了可以明确目的基因的缺失在特定组织或细胞类型之中发生，还可以限制发生的特定时间。
与普通的 KO 相比，CKO 无疑提供了更精准确凿的不在场证明。
这样的故事当然也就更有说服力，再也不怕 reviewer 质疑啦！完美！不过，如果你看到这里就满心欢喜，小编只能说：TOO YOUNG TOO SIMPLE!条件性基因敲除美丽的背后可是暗藏玄机呢！条件性基因敲除的这些坑，你踩过几个？组织特异性 Cre 其实没那么特异？我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一样？原来 Cre 小鼠用雌鼠和用雄鼠还不一样？我的 CKO 小鼠为什么基因还没被敲除？Cre 小鼠也会不育？广泛表达的 Cre 在所有组织表达不一样高？诱导型 Cre 其实会漏？下面就让小编来给你填土埋坑！文末有彩蛋哦，可别等不及直接拉到最后看，错过前面的干货就可惜了～组织特异性 Cre 真的那么特异吗？师兄，应该是肝脏特异表达的 Cre，怎么好像在脑里也有表达？唉，理想是丰满的，而现实往往是骨感的。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过人为地改变生物体的基因组，使得某个特定基因在生物体中失去功能。
基因敲除技术在动物模型研究中得到了广泛的应用，特别是在小鼠模型的构建中发挥着重要作用。
下面将介绍基因敲除小鼠的原理及其应用。
基因敲除小鼠原理。
基因敲除小鼠是指通过基因工程技术，将小鼠的某个特定基因进行改变，使得该基因在小鼠体内失去功能。
基因敲除小鼠的构建通常分为以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先需要选择需要敲除的目标基因，通常选择与某种疾病或生理过程相关的基因作为目标。
2. 构建敲除载体，将目标基因的敲除载体导入到小鼠的胚胎干细胞中，使得目标基因在胚胎干细胞中发生敲除。
3. 胚胎干细胞筛选，经过敲除载体导入后，对胚胎干细胞进行筛选，筛选出发生了基因敲除的干细胞。
4. 小鼠胚胎的移植，将发生了基因敲除的胚胎干细胞移植到受精小鼠卵母细胞内，通过体外培育和移植到母体小鼠子宫内，使得基因敲除小鼠的胚胎发育成熟。
5. 基因敲除小鼠的鉴定，对出生的小鼠进行基因型分析，确认是否成功构建了基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠的应用。
基因敲除小鼠模型在生物医学研究中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 功能基因研究，通过敲除特定基因，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生物体生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
2. 疾病模型构建，基因敲除小鼠模型可用于构建各种疾病模型，如肿瘤模型、免疫缺陷病模型等，用于研究疾病的发病机制及寻找治疗方法。
3. 药物筛选，基因敲除小鼠模型可用于药物的筛选和评价，通过观察敲除某个基因后对药物疗效的影响，为新药的研发提供重要参考。
4. 基因治疗研究，基因敲除小鼠模型可用于基因治疗的研究，通过敲除某个致病基因或导入正常基因，探索基因治疗的可行性及疗效。
总结。
基因敲除小鼠模型是一种重要的生物医学研究工具，通过对特定基因的敲除，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
基因敲除鼠原理 -回复
基因敲除鼠原理-回复基因敲除鼠是一种常用的实验动物模型，用于研究基因功能和疾病机制。
基因敲除是指通过人为手段删除动物体内的特定基因，从而观察基因缺失对生物体的影响。
在本文中，我们将详细介绍基因敲除鼠的原理和步骤。
1. 鼠标基因组定位和筛选首先，需要确定目标基因在鼠标基因组中的位置。
通过鼠标基因组浏览器等数据库和工具，我们可以获取目标基因的相关信息，包括基因的结构、启动子和剪接变异等。
在确认目标基因的位置后，接下来需要选择适合的切割位点。
2. 制备敲除载体基因敲除的一个关键步骤是通过亚克隆技术制备敲除载体。
首先，需要设计合成两个与目标基因两侧序列互补的引物。
引物设计时需要考虑到引物的特异性和合成的效率。
然后，利用聚合酶链反应(PCR)和DNA合成技术，我们可以扩增和合成两个互补的引物序列。
接下来，将扩增得到的两段DNA序列进行连接，形成敲除载体。
3. 选择胚胎干细胞接下来，在实验室条件下，需要选择和培养适合的胚胎干细胞。
胚胎干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和分化为不同类型细胞的能力。
这些细胞通常从早期胚胎中获得，可以通过培养和传代来扩增。
4. 转染敲除载体和选择阳性克隆将敲除载体转染到胚胎干细胞中是基因敲除鼠实验中的关键步骤之一。
转染一般采用电穿孔法或者病毒介导的转染技术。
转染后，通过添加适当的选择性抗生素，可以选择出转染了敲除载体的阳性克隆。
5. 形成敲除鼠模型得到阳性转染克隆后，可以通过将这些细胞注入早期胚胎的内质网，进一步培养和发展。
通过将这些胚胎移植到代孕母鼠子宫中，可以等待胚胎发育并诞生敲除鼠模型。
6. 验证基因敲除效果最后一步是验证基因敲除的效果。
可以通过PCR和DNA测序等分子生物学技术进行验证。
PCR可以检测目标基因的DNA序列是否被成功替换或删除。
而DNA测序则可以进一步验证目标基因的序列是否发生了改变。
基因敲除鼠模型的建立可以提供对特定基因功能的深入了解，并帮助研究人员揭示基因的作用和疾病机制。
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敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
它们的毛色不同。
因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。
ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。
10、何谓Flox小鼠？所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。
另一个系统是为了把目的基因去掉。
Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。
理论上是没有区别的。
只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。
其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。
现在大家做一个Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。
2) Flip酶的活性比较低。
Flip酶是从酵母中分离出来的。
其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。
尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。
把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。
即使Flip的活性不高，也可以得到Flox小鼠。
这些Flox 小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。
反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。
这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。
如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。
那个时候筛选起来特别麻烦。
因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。
需要很多的时间和精力。
12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因 1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2）条件性基因敲除（Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP, LacZ, TdTomato等）； 4）基因敲降（Knock-down): 通过降解mRNA的方法降低蛋白的表达水平（一般是用microRNA或siRNA)。
5）转基因：在体内过表达一个特定基因，就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。
13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。
许多实验室，包括我们公司，都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。
原因不是很清楚,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。
可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。
另外，毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一定完全一致。
也有人认为雄性ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。
现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。
14、ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入,在原来的设计中，目的基因cDNA上游带有一段转录终止序列“Stop”（3个拷贝的SV40多聚A序列，tPA）,转录终止序列的两端各有一个Loxp位点，将此结构定点嵌入Rosa26基因位置，整个结构的转录受Rosa26启动子控制。
在没有Cre的情况下，由于Rosa26启动子与目的基因之间“STOP”的存在，目的基因不能被表达。
如果有Cre表达， Cre重组酶将去除“STOP”，Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。
但是，由于Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。
为了解决这一问题，可以对原Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG启动子, 该启动子由鸡actin启动子和CMV增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。
15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从exon1敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计，不能从exon1开始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到启动子区域，因为很难预测启动子和所有调控元件的位置，loxp的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1开始敲除。
16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技术方法主要是siRNA。
对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个siRNA，并对每一个siRNA进行验证（一般利用细胞系），这就造成筛选具有干扰作用siRNA 的选择难度相当大。
2）一般情况下，RNAi对于基因的抑制不会很完全。
在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5天，以验证siRNA的抑制功能。
而在小鼠体内，siRNA尽管可以降低mRNAs的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。
一是蛋白表达水平虽然达不到正常水平，但可能同样发挥完整的功能；二是蛋白表达水平降低会导致蛋白降解速度降低，从而使蛋白的整体水平得到补偿。
所以，除非非常运气，siRNA转基因一般很难得到比较肯定的结果。
如果不能完全阻断基因的表达，利用siRNA进行基因敲降时沉默掉的基因仍保留一定的表达信号，可能会得到无法解释的实验数据。
除非是为了研究siRNA,或miRNA在体内的功能（而不是研究siRNA/miRNA所对应的候选基因），一般我们不建议利用siRNA法进行基因敲除的设计。
在这种情况下，我们通常会建议客户做基因敲除来达到目标基因缺失其原始蛋白功能的目的。
17、为什么来源于129背景的小鼠胚胎干细胞的模式小鼠一定要在C57BL/6背景的小鼠上进行回交？1）发明小鼠基因敲除技术以来，传统上一直用129遗传背景的小鼠胚胎干细胞进行基因打靶制备模式小鼠，然后在C57BL/6等近交系小鼠上回交（back-cross)超过10代，才能进行诸如免疫学、癌症、神经学等绝大部分生物医学研究。
回交至少需要2年多的时间，给科研工作者在时间上、金钱上造成很大损失。
比如生物实验经常进行诸如细胞器官移植等实验，我们从动物供应商得到的小鼠多数是C57BL/6或Balb/C等纯系小鼠，而很少供应大量129小鼠以进行实验。
如果由129品系ES细胞制备的模式小鼠在C56BL/6品系上回交的代次不够，就会带有很多129小鼠抗原。
将其细胞等移植到C57BL/6或其他近交系小鼠后，受体鼠会由于自身免疫排斥的原因，将转移的细胞杀死或产生耐受现象。
2）由于129品系小鼠遗传背景复杂，得到的模式小鼠需在C57BL/6等近交系小鼠上做回交，并且回交次数不同也会造成实验结果重复性差。
这对开发制作标准模式动物是一个很大的难题，对生物科研、医药企业、安评中心、药检部门等，也是一个很大的缺憾。
所以如果能够直接用C57BL/6 ES 细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠，保证了模式小鼠的稳定性，极大的提高了制作速度缩短了科研周期。
18、既然129背景的模式小鼠不能直接用于多数实验科学研究，为什么目前仍有科研机构利用129背景的小鼠胚胎干细胞制备模式小鼠？目前常用的129品系ES细胞的优点是它们比较皮实容易操作。
与其相对应能够用于基因打靶的C57BL/6遗传背景的ES细胞品系目前世界上少之又少也很难得到，C57BL/6 ES cell比较娇嫩，比如支原体污染就容易造成没有种系传递。
现今国外做129遗传背景模式小鼠一般在35000美元，而用C57BL/6 ES 细胞研发模式小鼠，价格一般在50000－80000美元之间。
但在增加科研竞争力和省去了回交时间等多方面来考虑，制备C57BL/6敲除小鼠还是值得的。
19、KO First 技术流程KO-First技术是通过在内含子中插入一个两边带有FRT位点的基因破坏盒来达到敲除的目的，这个破坏盒含有Splice acceptor (SA)(SA发挥剪接作用后，会将基因序列剪接，相应的片段就会被KO，所以叫KO First)，报告基因和Neo。