第六章 分子发光分析法
分子发光分析法五种去活化过程
分子发光分析法五种去活化过程
一、表面活性剂洗涤
表面活性剂洗涤是一种常见的去活化过程，洗涤分子表面上的污染物，降低并去除和阻止分子表面上的污染物对发光特性的影响。
分子活性剂洗
涤试剂可以根据需要分类，包括非离子表面活性剂、离子表面活性剂和混
合表面活性剂。
通常情况下，洗涤剂应与活性剂结合，以提高洗涤效率，
同时具有良好的低温过程安全。
表面活性剂洗涤可以减少分子表面的污染物，从而改善样品的发光特性，如改善发射光谱，提高发射效率，并可能
改善分子检测的灵敏度。
二、抗化学处理
抗化学处理是指在特定条件下，通过在分子表面涂覆一层屏蔽膜，阻
止日常活动（如体积缩小，局部温度升高等）对分子表面造成的影响，从
而保持稳定性和发光性质。
抗化学处理可以在低温下进行，不改变分子组成，而且耐受性更好。
三、光致化学聚合
光致化学聚合是将分子用光进行处理，使用不同的光谱来影响分子的
特性，使其可以在恒定的环境中提供更稳定的发光性能。
四、气氛处理
气氛处理是指在恒定温度和压力的环境下，利用气体作用去活化分子
表面。
该过程可以去除表面污染物，改善发光特性，如改善发射光谱或提
高发射效率。
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
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第六章分子发光分析法1．解释下列名词：（1）荧光；（2）磷光；（3）化学发光；（4）荧光激发光谱；（5）荧光发射光谱；（6）荧光量子产率；（7）荧光猝灭。
答：（1）荧光如果分子被激发到某个电子激发态的某个振动能级上，处于这个能态的分子会通过振动弛豫、内转换等一系列非辐射方式衰变到S 1态的最低振动能级，然后发生10S S →的辐射跃迁，这个辐射跃迁过程即发射出荧光。
（2）磷光分子被激发到某个电子激发态的某个振动能级上后，通过振动弛豫、内转换和体系间窜跃等一系列非辐射方式衰变到T 1态的最低振动能级，然后发生01T S →的辐射跃迁，这个辐射跃迁过程即发射出磷光。
（3）化学发光在某些化学反应中，反应产生的能量可以光辐射的形式释放出来，这种现象称为化学发光。
（4）荧光激发光谱以不同波长的入射光激发荧光物质，并在固定波长处测量激发出来的荧光强度，然后以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制关系曲线，便得到荧光激发光谱。
（5）荧光发射光谱固定激发光的波长和强度不变，测量不同波长处发射的荧光强度，绘制荧光强度随发射波长变化的关系曲线，便得到荧光发射光谱。
（6）荧光量子产率荧光量子产率是指荧光物质被激发后所发射荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比值。
（7）荧光猝灭荧光物质与溶液中其他物质发生作用，使荧光强度减弱或者消失的作用称为荧光猝灭。
2．简述影响物质的荧光发射的主要因素。
答：影响物质的荧光发射的主要因素如下：（1）分子结构①共轭 键体系：发荧光的物质中都含有共轭双键的强吸收基团，共轭体系越大，荧光效率越高；②刚性平面结构：荧光效率高的物质，其分子多是平面构型且具有一定的刚性；③取代基的影响：取代基对荧光物质的荧光特征和强度有很大影响，给电子取代基可使荧光增强，吸电子取代基使荧光减弱。
（2）环境因素①溶剂的影响：溶剂的极性对荧光物质的荧光强度产生影响，溶剂的极性越强，荧光强度越大；②温度的影响：温度对溶液荧光强度影响明显，对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁引起的荧光的效率降低；③pH的影响：溶液pH值对含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质有影响；④内滤光作用和自吸收作用：溶液中若存在能吸收激发光或荧光的物质，就会使实际测到的荧光减弱。
第六章分子发光分析法
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法和分子吸收分光光度法（MMS）是物理化学中测定物质含量和生物物质含
量的两种常用方法。
它们之间有共同点和不同之处，本文主要就这二者的原理和方法进行
介绍。
分子发光分析法（MALS）是用物质中的激发态分子把紫外线能量转换为可见光，用以表征
物质的测定方法。
该方法工作原理为紫外线照射激发态分子，激发态分子把紫外线能量转
变为可见光，然后通过光电器件检测发出的可见光，最终得出物质的测定结果。
MALS技术的优点在于检测结果准确，具有快速性，还可以检测生物样本中物质含量。
而分子吸收分光光度（MMS）是通过测量物质吸收入射光的程度，来表征物质的检测方法。
这种技术工作原理是将光源照射在样本上，样本中的物质会吸收一部分入射的紫外线，而
剩下的光经过反射和透射而到达检测器，最终通过计算获得物质的测定数值。
比较MMS和MALS，MMS技术具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，而且不受多种物质的干扰，也可以检测生物样本中的物质含量。
总之，MALS和MMS都是通过激发态分子转换紫外线能量为可见光，然后通过光电器件检测可见光，来判断物质的含量的两种常用技术，它们的优点和特点主要是MALS检测结果准确，具有快速性，而MMS则具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，也可以检测
生物样本中的物质含量。
第六章荧光法
CH3
CH3
CH3 CH3
维生素E： 激发波长295nm 发射波长324nm
硫色素荧光法
K 3 Fe(CN ) 6 NaOH 维生素B1
溶解后 （铁氰化钾）氧化
酸 正丁醇 荧光消失 硫色素 蓝色荧光 碱
激发λ=365nm； 发射λ=435nm
N H3C N
4.猝灭剂（quencher）的影响 荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它 溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消 失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。
引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂，如 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合 物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性 物质。
荧光猝灭的主要原因是碰撞猝灭。 碰撞猝灭：处于激发单重态的荧光分子 与猝灭剂碰撞后，使激发态分子以无辐 射跃迁回到基态，产生猝灭。
CH 2 NH 2 HCl
N S
CH 3 C 2 H 4 OH
硫胺素
N H3C N N
N S
CH 3 C 2H 4OH
硫色素
四、环境对荧光的影响
1.温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随 着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增 加，相反，温度升高荧光效率将下降。 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光 效率为100%。
荧光
延迟荧光
磷光
系间串越 内转换
外转换
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4～10s，第一激发三重态的最低振动能级→基态。
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-9 ~ 10 -7s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度快。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法和分子吸收分光光度法是两种常用的分子光学技术。
它们都是利用自由基反应的原理测定物质的技术。
分子发光分析法是基于激发分子发射光，从而测定物质浓度的技术。
它使用一种特殊的分子发射剂与被测物质反应，当被测物质与分子发
射剂反应后，分子发射剂会被激发发射出特定波长的光，而这些发射
出的光则可以用来测定被测物质的浓度。
分子吸收分光光度法是基于激发分子吸收光来测定物质浓度的技术。
它使用一种特殊的分子发射剂，它能把一种特定的波长的光吸收，而
这种光则能够激发被测物质。
当被测物质激发后，它会吸收一定波长
的光，而这些被吸收的光则可以用来测定被测物质的浓度。
通过对比可以看出，分子发光分析法和分子吸收分光光度法各有优劣，它们都可以用来测定物质的浓度，但都存在一些使用上的限制，比如
分子发光分析法在测定低浓度物质时会有一定的误差，而分子吸收分
光光度法则受到测量物质种类的限制。
因此，在选择物质浓度检测的
技术时，应根据具体情况选择适合的技术，以得到更准确的测定结果。
仪器分析各章习题与答案
第一章绪论问答题1. 简述仪器分析法的特点.第二章色谱分析法1．塔板理论的要点与不足是什么？2．速率理论的要点是什么?3．利用保留值定性的依据是什么？4．利用相对保留值定性有什么优点?5．色谱图上的色谱流出曲线可说明什么问题？6．什么叫死时间？用什么样的样品测定？．7．在色谱流出曲线上，两峰间距离决定于相应两组分在两相间的分配系数还是扩散速率？为什么？8．某一色谱柱从理论上计算得到的理论塔板数n很大，塔板高度H很小，但实际上柱效并不高,试分析原因。
9．某人制备了一根填充柱，用组分A和B为测试样品，测得该柱理论塔板数为4500，因而推断A和B在该柱上一定能得到很好的分离,该人推断正确吗?简要说明理由。
10．色谱分析中常用的定量分析方法有哪几种？当样品中各组分不能全部出峰或在组分中只需要定量其中几个组分时可选用哪种方法?11．气相色谱仪一般由哪几部分组成?各部件的主要作用是什么?12．气相色谱仪的气路结构分为几种？双柱双气路有何作用？13．为什么载气需要净化?如何净化？14．简述热导检测器的基本原理。
15．简述氢火焰离子化检测器的基本结构和工作原理。
16．影响热导检测器灵敏度的主要因素有哪些?分别是如何影响的?17．为什么常用气固色谱分离永久性气体？18．对气相色谱的载体有哪些要求？19．试比较红色载体和白色载体的特点.20．对气相色谱的固定液有哪些要求？21．固定液按极性大小如何分类？22．如何选择固定液?23．什么叫聚合物固定相?有何优点?24．柱温对分离有何影响?柱温的选择原则是什么？25．根据样品的沸点如何选择柱温、固定液用量和载体的种类?26．毛细管色谱柱与填充柱相比有何特点？27．为什么毛细管色谱系统要采用分流进样和尾吹装置？28．在下列情况下色谱峰形将会怎样变化?(1)进样速度慢；（2）由于汽化室温度低,样品不能瞬间汽化；（3）增加柱温；(4）增大载气流速；（5）增加柱长；(6)固定相颗粒变粗.29．二氯甲烷、三氯甲烷和四氯甲烷的沸点分别为40℃，62℃，77℃，试推测它们的混合物在阿皮松L柱上和在邻苯二甲酸二壬酯柱上的出峰顺序.30．流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪些?31．高压输液泵应具备什么性能?32．在HPLC中，对流动相的要求是什么?33．何谓梯度洗脱?适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么不同?33．什么是化学键合固定相?化学键合相的特点有哪些?34．反相键合相色谱法具有哪些优点?35．为何高效液相色谱法一般采用全多孔微粒型固定相?36．指出下列物质在正相色谱和在反相色谱中的洗脱顺序：37．在硅胶柱上，用甲苯为流动相时,某物质的保留时间为28 min，若改用CCl4或CHCl3。
分子发光分析法精专业资料
2021/9/14
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2021/9/14
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应
a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
2021/9/14
生物发光分析应用 1
在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素
(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光
发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；
Байду номын сангаас
复AA素合TM和P物P荧·+与LL光H氧H素反·+酸E应E+的，+O复M产合g生物化和学[镁氧发的化光焦荧：A磷光M酸素P·盐]L*(Hp+p·iA)E：M+PM+Cg Oppi++H2OH 最在挥化化烟C鲁Kd发最（最装N灵在 发在（鲁发烟OcHO3为大富发学学酰米射大1大置敏富射化2米射酰/d22） ）→t反O发 氢 性 发 发 胺 诺 光 发 发 流 度 氢光 学 诺 光 胺=在+*可O应射火硫光光腺在强射射程1火 谱反在谱腺K→n一2c2检速波焰化反反嘌碱度波波：焰 范应碱范嘌g；H+定/C测c率长中物应应呤性与长长中 围过性围呤→OHm条低常：：效存二溶硫：， ：程溶：二S42-（件9N3OO至数率在核液化也 中液核26365；O12下0906+n。：于苷中物存 ，中苷010000、+m，0h0～～nn生酸与浓在 某与酸00-mmH；H峰.957物双度着些双((2；；207NNmS值00OC体氧的很 化氧AAonn、光石DDlmm水平强 合水(/2L萤HHC强英2；；的方的 物的的))H火在在度管3反成化 接反H虫细细S与中2应正学 受应H、O菌菌被进、过比发 能过2海中中测行；程。光 量程C洋的的物）H：反 而：发黄黄浓3应 被2S光素素度C； 激生酶 酶H成发3物作作线2等，+)用用性中在从下下；，富激，，称氢发p在在生H火态氧氧物焰7返化化发中-回型型光燃8基黄黄(烧b态素素io，时l单单u产，m核核生i发n苷苷e很射s酸酸c强出e((FF的n一cMM化e定AA)。学))波存存发长在在2光的下下（光，，蓝。发发色生生）发发：光光反反应应
分子发光分析法与分子
分子发光分析法与分子
分子发光分析法是一种分子生物学分析技术，该技术利用激发和荧光等光学原理，可准确、灵敏地检测某一特定识别序列的DNA或RNA，根据检测结果用于病原
体的鉴定、对感染过程的追踪及毒素的检测等方面的实验。
首先，分子发光分析是一种特殊的酶联免疫吸附实验，通过向样品中添加放射
性标记的双链DNA探针，由特定酶解离双链，探针与核酸结合，可以检测出特定序列的DNA或RNA。
使用这一技术，可以追踪影响基因表达和变异的基因或基因产物。
其次，分子发光分析法还可以用于检测DNA片段和品种变异，从而便于理解特
定基因之间的关系，以及定义物种在进化过程中的节点。
通过研究其他物种的变化，可以让科学家更好地了解人类的进化和免疫过程。
综上所述，分子发光分析法在病原体鉴定、追踪感染过程、毒素检测和基因变
异检测等科学研究中发挥着重要作用。
同时，由于分子发光分析法检测精准、信息丰富，已经成为全球多学科研究的重要手段之一。
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
第六章分子发光荧光磷光及化学发光
反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem
共振荧光(Resonance)：
λex = λem
2. 分子荧光(磷光)光谱
(1) 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发 射出不同波长的荧光。
MX n hvi MX* I F 4 8 0 0
４．内转换
内转换指的是相同多重度等能态间的一 种无辐射跃迁过程．当两个电子能级的 振动能层间有重叠时，则可能发生电子 由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能 层的电子的激发态．内转换过程在1013~10-11s时间内发生，它通常要比由高 激发态直接发射光子的速度快得多．
５．外转换
激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相 互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减 弱甚至消失的过程称外转换．这一现象称 为“熄灭”或“猝灭”．
直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用 分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些， 才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波 长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧 光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而 提出“荧光”这一术语。
1867年，Goppelsroder进行了 上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
υ
, 1
子 可 见
υＳ,01 υ2 υ1 υ0
吸
收
光
谱
3
2 1
J
0
3
2 1
J
0
3
2 1
J
0
3
Ｓ0
2 1
J
0
远红外光谱
λ振动 25~1.25μm
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但当不同多重态的两个电子能级有较大重叠时，处于这两个
能级上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋 -轨道 耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间窜跃。
不同多重态的两个电子能态间的非辐射跃迁
第二电子激发态
S2 T2
第一电子激发态
• 1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）
• 在同一电子能级中，电子由高振动能级迅速转至该电子能 级低振动能级，将多余的能量以分子振动能形式消耗掉一 部分，这样的过程，称为振动弛豫。
高振动能级
→
低振动能级
• 发生振动弛豫的时间：10-12s
设处于基态单重态中的电子吸收波长为 λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二 单重态S2及第一单重态S1。 第二电子激发态
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-6～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
第二电子激发态
S2
三重态
T2
第一电子激发态
S1
T1
基态S0
• 3）外转换（External Conversion，EC）
受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换 ,而使荧
光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”
（quenching）。
• 4）系间窜跃（Intersystem Conversion，ISC）
S2 振动弛豫
S1
第一电子激发态
T1
Байду номын сангаас
三重态
基态S0
l 1 λ1
l2λ 2
•2）内转换（Internal Conversion，IC）
当两个电子能级非常靠近 , 以致其振动能级有重叠时，发生 电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级， 相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁 【例】:高电子能能级→→低电子能级 S2 →→ S1 T2 →→ T1 发生内转换的时间： 10-13 ～10-11s
迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
第二电子激发态
S2 T2
第一电子激发态
S1 T1
三重态
基态S0
磷光
系间跨跃 振动弛豫 磷光发射 S T （高振动能层） T （低振动能层） S 1 1 1 0
内转换 S2
振动弛豫
内转换
系间窜跃
S1 能 量 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 光
Pauli不相容原理：分子中同一轨 道所占据的两个电子必须具有相反 的自旋方向，即自旋配对。
对电子，平行自旋要比成对自旋更 稳定。
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1 单重态：如果分子中全部轨道里的 三重态：如果电子在跃迁过程中 电子都是自旋配对的，即s=0, 分 还伴随着自旋方向的改变，这时 子的多重度=1, 该分子体系处于单 分子具有两个自旋不配对的电子 重态 基态S0 T2 T1 三重态
本章内容
6. 6. 6. 6. 6. 6. 0 1 2 3 4 5 引言 分子发光的基本原理 分子荧光定量分析 荧光光谱仪 荧光光谱法的特点及其干扰因素 荧光光谱法在农业上的应用
分子发光
分子发光分析：依据物质分子吸收一定的能量跃迁到较高电 子激发态后，在返回基态时有光谱辐射而建立的分子方法。
按激发的模式分类： 分子发光
2
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
‘ 2
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如
)
。 c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布与第 一激发态上的各振动能级分布 类似； 基态上的零振动 能级与第一激发 态的二振动能级
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或
磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级 图
振 动 能 级
分子中电子能级、 振动能级和转动能级示意图
转 动 能 级
• 基态(S0): 室温下，分子处于基态的振动能级。 • 所有电子遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特规则。 • 激发态: 被激发后, 能量变高, 属非稳状态。 • 单重态（S） • 三重态（T） 洪特规则：处于分立轨道上的非成
T1
T2
吸 收
振动弛豫
S0 l1 l2 l 2 l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长 (选最大发射波长 ),化合物发射的荧光 (磷
光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
S1 T1
三重态
基态S0
• 5） 荧光发射
• 荧光：分子中电子从单重激发态的最低振动能级在很短时
间（ 10-9-10-6s ）跃迁到基态各振动能级时所产生的光子
辐射称为荧光。 • 荧光发射：产生荧光的过程 • S1→→ S0
第二电子激发态
S2
T2
第一电子激发态
S1
三重态
T1
基态S0
荧光
• 6）. 磷光发射 从单重态（S）到三重态（T）分子间发 生系间跨越跃迁后，再经振动弛豫回到三 重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃
光致发光 化学发光 生物发光
荧光
磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生
• 1.1荧光及磷光的产生
电 子 能 级