4种灰树花多糖测定方法的比较

顾华杰,黄金汇,金 琎,等.4种灰树花多糖测定方法的比较[J].江苏农业科学,2011,39(4):400-402.

4种灰树花多糖测定方法的比较

顾华杰1,黄金汇1,金 琎1,胡翠英1,王桃云1,陈家长2

(1.苏州科技学院化学与生物工程学院,江苏苏州215009; 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,江苏无锡214081)

摘要:采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、费林滴定法等4种方法测定了液体发酵法培养的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多糖,测定了每种方法的最佳吸收波长、标准曲线,比较了仪器精密度、重现性、稳定性及加样回收率。结果表明:苯酚-硫酸法测定胞内多糖较好,最佳吸收波长为485nm;3,5-二硝基水杨酸法测定胞外多糖较好,最佳吸收波长为490n m。

关键词:灰树花;多糖;苯酚-硫酸法;蒽酮-硫酸法;3,5-二硝基水杨酸法;费林滴定法

中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2011)04-0400-03

(上接第399页)

3 结论

料液比、超声波辅助提取时间、提取温度均会影响马齿苋粗多糖提取量,其中提取温度影响最大,其次是固液比,提取时间的影响最小。通过单因素试验和L9(33)正交试验得出马齿苋粗多糖的最佳提取工艺条件为:固液比1g 30mL,温度70 ,浸提时间30m in。在最佳工艺条件下,开花期野生马齿苋草粉中粗多糖提取量为(10.1919 0.0403)%(风干基础)。

开花期野生马齿苋草粉中粗多糖相对常规饲料而言其含量较高,预计将马齿苋草粉添加到动物饲料中可以起到类似中草药饲料添加剂的某些功能,在提高动物免疫力方面能起到一定作用,但是作用程度还需通过动物试验进行深入研究和验证。

参考文献:

[1]孔 娟,刘晓宇,王蕊霞,等.葛根多糖和黄酮综合提取工艺优化

[J].食品科学,2010,31(6):43-47.

[2]朱建飞,吴谋成,冯 睿,等.菜籽粕中水溶性多糖提取工艺优化

[J].农业工程学报,2006,22(12):251-254.

[3]肖美添,杨军玲,林海英,等.紫菜多糖的提取及抗流感病毒活性

研究[J].福州大学学报:自然科学版,2003,31(5):631-635. [4]王亚飞,毕红梅.超声波法提取香菇多糖的研究[J].内蒙古科

技与经济,2004(14):124-125.

[5]王 莉,刘志勇,鲁建江,等.微波技术辅助测定马齿苋中总黄酮

和多糖的含量[J].食品工业科技,2002,23(5):70,73.

[6]田光辉,刘存芳,赖普辉.马齿苋多糖的超声提取及活性试验研

究[J].食品研究与开发,2007,28(2):7-10.

灰树花(Grifola frondosa)是多孔菌属的一种大型真菌,别称贝叶多孔菌、栗子蘑、佛菌、重菇等[1]。经过大量的化学和药理分析发现,灰树花多糖具有明显的抗肿瘤,抗H I V病毒,改善免疫系统,调节血糖、血脂及胆固醇水平,降血压等作用,可防止癌细胞的生成和转移,对艾滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能的紊乱都有一定的疗效,且无任何毒副作用[2]。灰树花多糖是富含 -1,6-糖苷键及 -1,3-糖苷键的真菌多糖,生理活性显著[3]。因此,对灰树花及其提取物中多糖含量的测定就显得十分重要。测定多糖的方法很多,但不同方法适用的范围不同,对不同来源多糖测定的准确性、稳定性、重现性也不同。本研究采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、费林滴定法等4种方法测定了液体发酵法培养的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多糖,并对这4种测定方法进行了比较,为准确测定灰树花多糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

收稿日期:2010-09-01

基金项目:现代农业产业技术体系建设专项(编号:nycyt x-48)。

作者简介:顾华杰(1981 ),男,江苏苏州人,硕士,实验师,主要从事食用菌生理生化研究。E-m ai:l li ongu@m ai.l us 。

灰树花菌种购自江苏省高邮市食用菌研究所。

PDA液体培养基:马铃薯20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾

0.3%,硫酸镁0.15%,维生素B10.001%,p H值自然。

1.2 试验方法

1.2.1 液体培养条件 500mL锥形瓶,200mL液体培养基,恒温振荡培养箱27 160r/m in培养7d。

1.2.2 多糖提取 胞内多糖测定采用微波辅助热水浸提法[4-5]:将培养好的菌液经4层纱布过滤后得菌丝体,蒸馏水冲洗干净后,置于干燥箱中70 烘干至恒重,取干菌丝体粉末2g,按1g 40mL料液比加入蒸馏水,置于微波炉中,中高火(750W)加热10m i n,放入沸水浴中30m in,1000r/m i n 离心取上清液即为胞内多糖水溶液。

胞外多糖测定采用醇沉法[5]:取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95%乙醇,混匀后4 下放置24h,4 4000r/m i n离心20m in,沉淀中加入80mL蒸馏水,沸水浴溶解30m in,1000r/m i n离心取上清液即为胞外多糖水溶液。

还原糖测定采用酸水解法[6]:取制得的胞内多糖或胞外多糖水溶液15mL,加入6m ol/L盐酸10mL,搅拌均匀后在沸水浴中水解30m i n,冷却至室温后用6mol/L Na OH中和至中性,蒸馏水定容至100mL,即得胞内或胞外的还原糖水溶液。

1.2.3 多糖提取

1.2.3.1 苯酚-硫酸法[7-8] 最大吸收波长的选择:吸取

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江苏农业科学 2011年第39卷第4期

0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,在冰水浴中加入5%苯酚水溶液0.5mL、浓硫酸5mL,混匀,沸水浴2m i n,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照,于400~ 600n m波长范围内扫描。

标准曲线制作:分别吸取0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL各3份,按最大吸收波长项下方法测定,以浓度(C)为横坐标,吸光度(D)为纵坐标,绘制标准曲线。

精密度试验:精确吸取葡萄糖标准品溶液0.4mL,按最大吸收波长项下方法测定5次D值。

重现性试验:分别取1mL的胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各5份,按最大吸收波长项下方法测定D值。

稳定性试验:分别取1mL的胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各1份,按最大吸收波长项下方法显色后,分别在10m i n、30m in、1h、1.5h、2h时测定D值。

加样回收率试验:取胞内多糖水溶液(稀释100倍)和胞外多糖水溶液(稀释10倍)各10mL,分别加入1mL葡萄糖标准品溶液后,各取5份1mL样液,按最大吸收波长项下方法测定D值,计算加样回收率。

1.2.3.2 蒽酮-硫酸法[7,9] 最大吸收波长的选择:吸取0.1m g/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,在冰水浴中加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL,混匀,沸水浴10m in,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照,于500~ 700n m波长范围内扫描。按最大吸收波长项下的测定方法,进行标准曲线的制作、精密度试验、重现性试验、稳定性试验和加样回收率试验。

1.2.3.3 3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)[6,10] 最大吸收波长的选择:吸取1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.6mL,加蒸馏水至1mL,加入DNS溶液2mL,混匀,沸水浴5m i n,冷水浴冷却后,加入9mL蒸馏水;以相应溶液作为空白对照,于400~600n m波长范围内扫描。

标准曲线制作:分别吸取1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL各3份,按最大吸收波长项下方法测定,以浓度(C)为横坐标,吸光度(D)为纵坐标,绘制标准曲线。

使用胞内还原糖水溶液(稀释5倍)和胞外还原糖水溶液,按最大吸收波长项下的测定方法,进行精密度试验、重现性试验、稳定性试验和加样回收率试验。

1.2.3.4 费林滴定法[10-11] 空白滴定:吸取费林甲、乙液各5mL于250mL锥形瓶中,加入蒸馏水10mL及1mg/mL葡萄糖标准溶液9mL,加热至沸腾,保持30s,趁热以每2s1滴的速度滴加葡萄糖标准溶液,至溶液蓝色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖标准溶液体积(V0)。

样品滴定:吸取费林甲、乙液各5mL于250mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL及胞内还原糖或胞外还原糖样品稀释液5mL,滴定管加入比预备滴定量少0.5mL左右的葡萄糖标准液,摇匀后加热至沸腾,保持30s后匀速滴入葡萄糖标准液,至蓝色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖标准溶液体积(V)。

还原糖(m g/mL)=(V0-V) 葡萄糖标准液浓度/参加反应的样液量 样品稀释倍数

重现性试验:分别取5mL胞内还原糖水溶液(稀释5倍)和胞外还原糖水溶液各5份进行滴定,记录每次耗用的葡萄糖标准液的量。

加样回收率试验:样品滴定时,在加入费林甲、乙液各5mL及蒸馏水10mL后,再加入胞内还原糖水溶液(稀释5倍)或胞外还原糖水溶液5mL+葡萄糖标准溶液1mL,然后进行滴定操作,重复5次,记录每次葡萄糖标准液的用量。1.2.4 数据处理 试验数据均采用Excel进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 苯酚-硫酸法

最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为485nm。

标准曲线制作:绘制标准曲线,得回归方程为y= 0.0082x+0.0352(r2=0.9996),表明葡萄糖浓度在5~ 100 g/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验:测得吸光值分别为0.376、0.375、0.377、0.376、0.376,平均值为0.376,RSD=0.188%,表明仪器的精密度良好。

重现性试验:对于胞内多糖,根据测得的吸光值计算得烘干菌丝体中多糖(以葡萄糖计)含量分别为0.182、0.179、0.177、0.174、0.170g/g,平均值为0.176g/g,RSD= 2.743%,表明该方法重现性良好;对于胞外多糖,根据测得的吸光值计算得液体培养基中多糖(以葡萄糖计)含量分别为21.659、26.780、23.610、25.073、22.878 g/mL,平均值为24.000 g/mL,RS D=8.275%,表明该方法重现性不好。

稳定性试验:对于胞内多糖,测得的吸光值分别为0.392、0.393、0.392、0.391、0.391,平均值为0.392,RS D=0.214%,表明胞内多糖溶液的测定在2h内基本稳定;对于胞外多糖,测得的吸光值分别为0.138、0.139、0.139、0.137、0.137,平均值为0.138,RSD=0.725%,表明胞外多糖溶液的测定在2h 内基本稳定。

加样回收率试验:一般加样回收率在80%~120%的效果较好[12],利用此指标及RS D的大小来判断加样回收率的优劣。对于胞内多糖,根据测得的吸光值计算得加样回收率分别为96.439%、93.756%、88.390%、85.707%、85.707%,平均回收率为90.000%,RSD=5.415%,表明加样回收率良好;对于胞外多糖,根据测得的吸光值计算得加样回收率分别为79.610%、72.902%、75.585%、68.878%、80.951%,平均回收率为75.585%,RSD=6.521%,表明加样回收率不好。2.2 蒽酮-硫酸法

最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为620nm。

标准曲线制作:绘制标准曲线,得回归方程为y= 0.0066x+0.0502(r2=0.9998),表明葡萄糖浓度在5~ 100 g/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验:测得吸光值分别为0.327、0.326、0.377、0.326、0.325,平均值为0.326,RSD=0.217%,表明仪器的精密度良好。

重现性试验:对于胞内多糖,根据测得的吸光值计算得烘干菌丝体中多糖(以葡萄糖计)含量分别为0.129、0.116、0.112、0.109、0.105g/g,平均值为0.114g/g,RSD= 7.967%,表明该方法重现性一般;对于胞外多糖,根据测得的

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顾华杰等:4种灰树花多糖测定方法的比较