沉淀反应PPT演示课件

20
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
21
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线
Mancini曲线： 大分子抗原
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直
径
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为
沉淀反应
（precipitation reaction)
1
第一节 沉淀反应的特点 可溶性抗原+相应抗体
肉眼可见的沉淀
2
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
8
絮 状 沉 淀 示 意 图 各管抗原倍比稀释
Ag
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
9
2. 抗体稀释法
本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反 应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。
3. 方阵滴定法
抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard) 滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗 体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。
10
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
百度文库
速率。
形成的复合物
3
沉淀反应可分三类
液体内沉淀 试验
凝胶内沉淀 试验
凝胶免疫电 泳技术
免疫浊度测定 絮状沉淀试验
单向扩散试验 双向扩散试验
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
4
第二节 液体内沉淀试验
絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形 成肉眼可见的絮状沉淀物。 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分 为三类：
32
1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定 4.抗原或抗体纯度鉴定
33
A BCDEF
Ag
Ab
A: 浓度Ag、Ab及分子量近似； B：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＜ Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＞ Ab ； D：浓度Ag＞Ab，分子量近似； E：浓度Ag＞Ab，分子量Ag ＜ Ab ； F：浓度Ag＜Ab，分子量Ag ＞ Ab ；
18
单 向 琼 脂 扩 散 试 验
Ag
Ab
试管法
19
一、单向扩散试验 （平板法） (single diffusion test)
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。
环的大小与抗原的浓度成正 相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
11
4. 方法评价
絮状沉淀试验方法简单，设备要求低， 敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明 显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适 比。
12
二、免疫浊度测定 (immunoturbidimetry)
23
标准品抗原浓度测定
不同病人抗原浓度测定
24
绘制标准曲线
1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
相应抗原浓度
25
26
27
影响因素
1.抗血清要求亲和力强、特异性好和效价高，注 意保存。
2.标准曲线必须每次制作。 3.每次必须加质控血清。 4.双环现象，不同扩散率抗原性相同的两个组分 5.Ig测定中，可出现测量值降低：单克隆抗体。 6.假阳性：多克隆抗体。
原理：当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二 者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速 形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液 体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度 进行测定从而检测抗原含量。
13
14
免疫浊度测定
影响因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
28
29
二、双向扩散试验
（ double immunodiffusion test）
原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应 孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处 形成白色沉淀线。
30
模拟图
Ag
原理示意图
Ab
1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧
染色标本图
31
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂 糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间 距在3～5 mm之间，在相对的孔中加入抗 原或抗体，放置湿盒37℃18～24h 后，观 察孔周围是否出现沉淀环。
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
15
免疫浊度测定
分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
16
第三节 凝胶内沉淀试验 （gel phase precipitation）
17
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度 梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置 形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰 胺凝胶。
絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀
5
一、 絮状沉淀试验 (flocculation)
•方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
6
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
7
1. 抗原稀释法
(1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物 最多的管为最适比例管。
48h 以 上 , 可 见 T3 为 直 线 ， T1 为 反 抛 物
线
22
Fahey曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直 径
t1 为 16 ～ 24h ； t2 为 24 ～ 48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线