3 基因表达检测

每管加1ml Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10％）， 迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5 －10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；
1. 加200 µ l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右； 2. 2-8 ℃ ，12000g 离心10-15分钟；
第三部分：基因表达检测
基因表达检测的应用范畴
检测自然变异等位基因的表达差异； 检测突变体基因功能的丧失或获得； 检测转基因的表达：OX & 抑制 & 突变。
基因表达检测的技术手段
RT-PCR (Reverse transcription PCR) Real-time PCR=qRT-PCR Northern Blotting
2. PCR反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设 置循环参数：如扩增片段的长度及mRNA 的丰度等； 3. 检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳； 4. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
PCR产物的电泳检测时出现拖带或 非特异性扩增带的可能原因
1. Taq酶过多； 2. Mg2+浓度不合适：Optimize [Mg2+] in a ladder of 0.5 mM; 3. 引物不特异、浓度过高、Tm值过高、引物形成二聚体; 4. 复性温度过低：三度幅度梯度提高; 5. 循环次数过多； 6. 模板量过多。
RT的两种关键酶
DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生
成具有5’－P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。体外
转录后除去模板DNA。
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。如常见的鼠白
血病毒反转录酶 M-MLV
实验设计
本实验以水稻叶片RNA为材料，检测水稻种子大 小基因GS5突变体(或内源任意基因)的基因表达；
RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测
1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳 2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳 3. 检测 0.5×TBE 4. 电泳：1× MOPS（3-(N-吗啉基）丙磺酸 ） 80 —150V 40 min —1h
基因表达分析的一般流程
Northern Blotting 反转录 RT-PCR (qRT-PCR)
RNA抽提
cDNA
基因特异性引导
Oligo(dT)引导
随机六核苷酸引物引导
Northern Blotting
PCR
Invented by Kary Mullis in 1983 and Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993
Contaminant Good ？ Degradation
Callus
Leaf
RNA降解的主要原因
1. 取样后没有立即抽提RNA； 2. 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 3. 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入70 ℃ ，而不是-20 ℃ ）； 4. 使用的溶液或器皿有RNase污染； 5. 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5。
7. 引物设计不合理，与模板不配对等。
RT-PCR与Northern杂交分析结果示意图（GS5）
1 l
1 l 1 l 20 l
6. incubate at 37℃ for 1 h. (The total volume should now be 20 l) ； 7. Inactive the reaction by heating at 70℃ for 10 min, then the first strand of cDNA can be used as a template for amplification in PCR；add 20-60ul ddH2O; -20-70 ℃; 8. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 l (2 units) of RNase H and incubate at 37℃ for 20 min.
各个阶段严重威胁RNA的完整性。
用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC（焦碳酸二乙酯 ）：形成组胺基团破坏RNase的活性；
2. 氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶； 3. 蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA的构建等分子生物学实验都至关重要；
RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少
RNA酶的污染。
RNA操作中应注意的关键问题：
防止RNase污染
外源RNase的主要来源： 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等
Total RNA RNase-free DNase
x l (~5g)
１l (１u / l)
10× DNase buffer
add DEPC-treated ddH2O
1 l
to 10l
4. Incubate at 37℃ or room-temperature for 15 min, then adding 50mM EDTA 1l and, incubated at 70℃ for 10 min to inactive DNase I；
操作步骤（三）: PCR
1. 在冰上配制下列反应体系 :
First strand cDNA Taq (5 u / 1 l) 10 × Ex Taq buffer dNTP mixture (2 mM) Primer F (10 mM) Primer R (10 mM) ddH2O 2l 0.3 l 2 l 2 l 0.25 l 0.25 l 13.2 l
4. 防止外源RNase的污染：
应戴口罩和手套，环境洁净； 玻璃器皿180º C烘烤3 hrs以上； 一次性用品如tube、 tip、塑料制品等使用DEPC蛋白质变 性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品； 电泳槽相关的用0.4M 的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。
操作步骤
•
•
液氮取样，液氮磨样，每管分装0.1克样品；
RNA抽提前应准备的其它试剂及物品
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿、异丙醇（RNA专用） 3. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave.
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
提取方法
苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优， 尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理
操作者的手、口、头发等
防止外源RNase污染的主要措施
1. 处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、 缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37º C处理溶液1小 时后，有的再高压蒸气灭菌15 min，烘干备用；
2. 180－300º C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的 商品化产品处理塑料制品；
RNA产量低的原因
1. 样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底
2. RNA没有完全溶解
DNA污染的原因
样品太多，所加试剂相对太少
用来分离RNA的样品中含有机溶剂
（乙醇，DMSO等），或碱溶液等
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA
实验中设置一个内参基因作为阳性对照，判断
RNA的定量及反转录、PCR等过程是否有问题； 设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除 DNA及PCR试剂方面引起的假阳性； 同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增 带型是否来源于反转录的cDNA。
操作步骤（一）RNA Preparation
1. Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent； 2. Test the RNA concentration by Nano2000； 3. Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube:
导致PCR产物很少或无扩增产物的原因
1. 点样或染胶问题;
2. 反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时 出了问题；
3. 目的片段太大，使用的DNA Polymerase无法扩增出目的片段；
4. DNA溶液中或反应体系中含有Taq酶抑制剂；
5. 退火温度太高； 6. Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽
提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解 细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分 离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA; 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可 以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子 克隆等。
有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA
在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由 tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快 的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。