DNA 指纹图谱分析方法

第10章 DNA指纹图谱分析方法

10.1 DNA指纹图谱产生的原理

10.1.1 高变异DNA序列的发现

1980年，Wyman 和 White在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA片 段，以其为探针进行RFLPs分析，检测到8个等位基因，平均杂合率超过75％，因此推测该 位点的多态性来源于DNA重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hyper variable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区， 如α-珠蛋白基因（Higgs等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell等 1982）、脂蛋白基因（Knott 等 1986）、D-Ha-ras癌基因（Capon等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm等 1983）等基 因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高 变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源 于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位 的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat，简称VNTR）（Nakmura等1987）。在小卫星DNA内，重复单位数目的高度变异是由于不 等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂 时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每 世代每千个核苷酸对在10－5～10－2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复 的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维 持上扮演着重要的角色。在DNA复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4个核苷酸对）演化的机制（Wolf等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。

大多数重复序列单位共有一个约 10～15个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA重组交换的热点，可促进小卫星DNA的不等交换（Jeffreys等 1985a；Wyman等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。

本章作者：丁 波，张亚平

第10章 DNA指纹图谱分析方法119

10.1.2 DNA指纹图谱的发现

1985年，英国来斯特大学遗传系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》杂志上报道了他们对人体基因组高变区的突破性研究。他们用肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列（重复单位长33bp）作探针，从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆。经序列分析，发现每个克隆都含有一个长0.2～2.0kb、由重复单位重复3～29次组成的小卫星DNA。尽管这8个小卫星的重复单位的长度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。他们用 16bp重复单位（主要为核心序列）重复29次而成的小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern杂交，在低严谨条件下杂交产生由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6进行测试，获得了类似的图谱。这种杂交图谱就像人的指纹一样因人而异，因而Jeffreys（1985b）等人称之为DNA指纹图谱（DNA finger print），又名遗传指纹图谱（genetic finger print）。产生DNA指纹图谱的过程就叫做DNA指纹分析（DNA finger printing）。

10.l.3 DNA指纹图谱的特点

DNA指纹图谱具有以下3个基本特点：

（1）多位点性：基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个DNA指纹探针（又称多位点探针）产生的某个个体DNA指纹图谱由10～20多条肉眼可分辨的图带组成。由于大部分杂合小卫星位点，仅一个等位基因出现在图谱的可分辨区内（两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在长度上差异很大），因而每条可分辨图带代表一个位点。很多的研究表明，个体DNA指纹图谱中的带很少成对连锁遗传，所代表的位点广泛地分布于整个基因组中（Burke等1987；Hiu等1985）。一个传统的RFLPs 探针一次只能检测一个特异性位点的变异性，所产生的图谱一般由l～2条带组成，仅代表一个位点。因此两者比较而言，DNA 指纹图谱更能全面地反映基因组的变异性。

（2）高变异性：DNA指纹图谱的变异性由两个因素所决定，一是可分辨的图带数，二是每条 带在群体中出现的频率。DNA指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所组 成的图谱必然具有很高的变异性。DNA指纹图谱在个体或群体之间表现出高度的变异性，即不同 的个体或群体有不同的DNA指纹图谱。一般选用任何一种识别4个碱基的限制性内切酶，这种变 异性就能表现出来。Jeffreys等 （1985b）对人的DNA 指纹图谱的研究表明，DNA指纹图谱中的 大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率大于70％，某些大片段的杂合率甚至高达100％。用 探针33.15进行DNA指纹分析时，发现两个无血缘关系的个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为 3× 10－11；而将探针33.15和33.6产生的DNA指纹图谱综合起来分析时，则这种概率为5×10－19，可见DNA指纹图谱具有高度的个体特异性。但是，同卵双胞胎的DNA指纹图谱是相同的，因其有完全相同的基因组（Hiu等1985）。值得注意的是，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，DNA指纹图谱大片段区域的变异性往往很高，而小片段区域的变异性则很低，因此在实际操作时往往将

小于 2kb的小片段跑出胶外或不作统计。