医学实验技术 细胞培养技术

一段时间叫一代。需要注意的是细胞培
养一代与细胞倍增（doubling）的概念
是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加
一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，
细胞可倍增2-6次。
• 细胞传一代以后，细胞群体一般要经过 潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。
• 以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种 后呈悬浮状态，在0．5-4 h内贴附于支 持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发 生，原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细 胞或无限传代细胞仅需6-24 h。
3. 培养细胞的生存条件
•
培养细胞需要特定的培养基和
培养设备。培养细胞在培养器皿中
生长，浸浴于培养液，并需要特有
的环境，包括一定的温度、湿度和
气体成分。
培养细胞的生存条件
培养皿 或培养瓶
营养物质糖、
氨基酸、维生 素、无机离子、 微量元素等
温度ຫໍສະໝຸດ Baidu湿 度和气体
由CO2恒温孵
育箱提供
生长 培养液
10％～20％
• 细胞培养的工作始于20世纪初目前广泛 应用于生物学、医学的各个领域，并且 是各种细胞工程技术的基础。哈里森 （ Harrison，1907），因此被称为 “组织培养之父”
一、基础理论
• （一）培养细胞的类型及其特点 • 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，
根据它们是否能贴附在支持物上生长的特 性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
培养基的种类
• 按其物质状态，分半固体培养基（如软 琼脂培养基）和液体培养基两类，其中 液体培养基（即培养液）使用最为广泛。 目前市场上有多种配制好的细胞培养液 出售，但价格较昂贵。实际工作中多用 市售培养基干粉来配制培养液。
• 配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎 牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多 少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和 不同研究目的。一般情况下需添加10 ％ ～20 ％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度， 称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死， 加2 ％ ～5％血清含量即可，称为维持培养液。
•
原代细胞一经传代后便称为细胞
系（cell line），进入传代期，此期在
全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺
盛，并能维持二倍体的核型。一般情况
下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢
以至完全停止，细胞进入衰退期，最后
死亡。
• 肿瘤细胞系可无限增殖而无衰 退期，正常细胞系也可在传代期 末期或衰退期发生自发转化，细 胞获得永生性即永久增殖的能力， 称为无限细胞系或连续细胞系。
3、培养细胞一代的增殖过程
•
培养细胞的生存环境是培养瓶、皿
或其它容器，生存空间相对孤立，营养是
有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需
分离出一部分细胞接种到其他容器，并及
时更新培养液，否则将影响细胞的继续生
存，这一过程叫传代（passage 或
subculture）。
•
从细胞接种到下一次传代再培养的
• 其优点是在培养液中生长，生存空间大， 允许长时间生长，便于大量繁殖。
（二）培养细胞的增殖过程
• 培养细胞的生命期
•
培养细胞的生命期（life span）指
的是细胞在培养中持续增殖和生长的时
间，一般可分为原代培养期、传代期和
衰退期。从体内取出细胞接种培养到第
一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。
• 随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细 胞群体进入指数增长期，此期又称对数 期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最 佳，适于进行实验研究；此期时间长短 因细胞本身特性及接种密度、血清浓度 而不完全相同，一般可持续3-5天。
• 随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接 触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细 胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数 目不再增加，但仍维持一定时间的活力， 此时应及时分离传代，否则细胞将因中 毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一 般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液 后即可迅速进入指数增长期。
• 此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗 生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素 100μg/ml）。
常见的培养基：
1、MEM(minimum essential media)
（1）贴附型
•
大多数培养细胞均为贴附型，
它们必须贴附在支持物表面生长，这
类细胞在体内时各自具有其特殊的形
态，但在体外培养时贴附于支持物后
形态上表现单一化而失去体内原有的
某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞
样。
培养细胞的类型及其特点
• 贴附细胞型MRC-5成纤维细胞
培养细胞的类型及其特点
• 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞
正常贴附型细胞的特点
• 接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑 制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞 的运动，因此细胞不会相互重叠于其上 面生长。
• 密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽 发生接触抑制，但只要营养充分，仍可 增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度 后，由于营养的枯竭和代谢物的影响， 细胞分裂停止，称为密度抑制。
• 肿瘤细胞的接触抑制及密度抑 制往往减弱或消失，因此细胞 可向三维空间发展，导致细胞 堆积，并可生长至较高的终末 细胞密度。
(2) 悬浮型
• 少数细胞在培养时不贴附于支持物上， 而以悬浮状态生长，包括一些取自血、 脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细 胞，以及一些肿瘤细胞。
• 细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小 的细胞团，胞体为圆形。
细胞培养技术
cell culture
上海交通大学医学院 刘湘帆讲师
细胞培养技术
• 从生物体内取出组织或细胞，在体外 (in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、 适当温度和一定营养条件下，对这些组织 或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结 构和功能，以便于我们观察研究，这种方 法就是细胞培养（cell culture）。有时 细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。
的血清
维持 培养液
2％～5％ 的血清
（1）培养基
• 培养细胞所需营养物质与体内细胞相同， 包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微 量元素等。细胞在体外生存于含各种营养 成分的培养基中。
• 来自于动物体液和分离组织提取的天然培 养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液 等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐 渐被合成培养基取代。