时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011

时间相关单光子计数法测量荧光寿命

（一）实验目的与要求

目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法

2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法

要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；

2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；

3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；

4、学习利用Origin软件处理实验数据。

（二）实验原理

1 时间相关单光子计数器工作原理

TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。

TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。

图1 TCSPC 的工作原理简图

图2 时间相关单光子计数

2 荧光寿命及其含义

假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dt

t dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：

τ = (Γ + k nr ) – 1

荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为:。

I ( t ) = I 0 exp ( - t /τ)

其中I 0 是时间为零时的荧光强度，τ为荧光寿命。也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态，有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态，这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。

3 荧光寿命测定中的数据处理

由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述:∑-=i

i t a t I )/ex p()(τ

式中αi 为第i 项的指前因子。衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。当所测量的荧光寿命较短时，实验数据就和光源的脉冲宽度，光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。为了去掉仪器响应对测量结

果的影响，需要解下面的积分方程：

)()()(k k k t I t L t N ⊗=

样品的实测荧光衰减曲线N (t k )，实际上为L (t k ) 与脉冲响应函数I (t ) 的卷积，即利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I (t )，进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ) 等有关参量。实际工作中一般以胶体SiO2 (商品名Ludox) 为虚拟样品进行测定,仪器响应函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。

（三）仪器与样品

仪器：LifeSpec Ⅱ荧光光度计

样品：甲基橙染料溶液

（四）实验步骤与内容

1、实验仪器的准备：打开CO1，主机和F900电源；打开计算机，双击桌面上F900图标进入工作站；光度计开始初始化，并进行自检；当荧光光度计自检结束，处ready 状态时，则可以开始测量；

2、点击进入Signal Rate 设置窗口，先将Excitation Wavelength 和Emission Wavelength 处的Δλ均设置为0.01nm ，按回车键(Enter)或者点击Apply 确认；

3、打开样品室的盖子，将待测样品放置于样品架上，注意放置样品的位置，使激发光能落在样品上并且样品发出的光能进入探测器，然后盖好；

4、在Signal Rate 设置窗口内输入相应的Excitation Wavelength 和 Em1 Wavelength 值，逐渐加大Δλ，并调节Iris Setting 使Em1获得一个合适的Signal Rate （注意：在设置后需要按下回车或者Apply 按钮设置才真正生效，Em1的Signal Rate 千万不要超过106）；

5、点击λ按钮，选择Emission Scan ，进入设置窗口，在Emission Scan Parameters 内设置波长扫描范围、扫描间隔（step ）、停留时间（Dwell Time ）和扫描次数（Number of Scans ），设置完毕后点击Start 即开始测量，得到发射光谱(荧光光谱)；

6、点击τ按钮，选择Manual Lifetime ，进入设置菜单，在Excitation 栏内设置好激发波长和Light Source ，在Emission 1栏内设置好发射波长和Detector ，将Live 选择框勾上，然后开始设置下部的Lifetime Sample 1菜单，在Rates 标签内一边观察Stop Rate 一边调节Iris Setting 使Stop Rate 务必在2000以下，再在Time Range 标签内选择一个合适的Time Range 和Channels ，在Stop Condition 标签内根据样品情况选择一个合适的条件，设置好之后，点击New 开始测试。

(五) 数据处理

1. 测量完成后，点击保存将原始文件保存到“C:\users\导师\自己的文件夹”；

2. 点击“Zoom In”按钮，然后在图上选取一个需要进行拟合的范围，在Data 菜单