时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011
荧光寿命_论文-自然科学论文
荧光寿命荧光寿命（ FLT）检测摘要这个技术手册介绍了荧光寿命（ FLT）这种新技术的基本原理。
从这本技术手册里，我们可以简单的了解与这项技术相关的理论基础和与之配合的实验条件，以及通过一项应用实例讨论了如何对实验中所获得的数据进行解析和归类的方法。
•微孔板技术在高通量筛选中的价值使用者利用一个 marker或者是标记物受光激发后，通过一台普通的微孔板阅读器，就可以监测生化和生物反应进程。
常用的读取模式包括检测吸收光，荧光强度(FI)，荧光偏振（FP），时间分辨荧光（TRF）。
一般没有方法能够包含所有可能的分析模式，如果达到这样的高分析程度，需要一个配套的方法能够覆盖尽可能宽的实验范围。
尽管如此，，还是会有一种方法被优选选择，通过它能够得到更可靠的数据，更高端的信息，以及迅速的读取数据。
荧光寿命被定义成荧光分析在回到基态之前驻留在激发态的时间。
荧光寿命对荧光标记物周围的微环境高度敏感。
当标记一个反应对，由于化学反应改变这个反应对的状态（例如在酶反应体系中）或者是发生了与其他结合伴侣的结合（例如受体 -配体的结合），将影响到上面所提到的微环境。
无论如何，检测荧光寿命将直接指示反应环境。
这类信号要远远强于通常会影响其它探测方法的干扰信号，因此它将为市场需求加入巨大的推动力。
Tecan Ultran Evolution detection platform已经融入了对荧光寿命的检测。
除了已经发展的各种检测方法以外，这项新技术使得Ultran Evolution技术平台具有更强的市场应用前景。
2.荧光寿命测定的原理用 Ultra Evolution测定荧光寿命采用的一种方法，称作时间关联的单光子计数（TCSPC）。
实验的基本流程显示在图1。
一个脉冲激光器重复激发样品。
调节激发脉冲的强度，使得对于任何一个脉冲，在探测器上只有一个光子被计数。
按照测量的激光脉冲和探测器感应之间的这段时间，将计数值引入已用荧光计数和时间绘制的柱状图。
基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术
基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术
盛翠霞;李田泽
【期刊名称】《强激光与粒子束》
【年(卷),期】2010(22)8
【摘要】采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命,时间相关单光子计数采用多波长通道同时记录荧光光子数,可以提高计数效率和信息量,还可以在稳态图像中分离不同荧光团,形成4维图像.并采用多光子激发技术,利用长波长光源发出的两个或多个光子可以激发出一个短波长的光子.多个光子必须几乎同时到达激发点, 才能提供被激发分子足够的能量以产生荧光.多光子激发波长较长, 生物组织对其散射减小,因而可以穿透到更深层的组织,从而提高荧光成像深度和空间分辨力,并减少对活体样品的损伤.
【总页数】4页(P1731-1734)
【作者】盛翠霞;李田泽
【作者单位】山东理工大学,电气与电子工程学院,山东,淄博,255049;山东理工大学,电气与电子工程学院,山东,淄博,255049
【正文语种】中文
【中图分类】Q631
【相关文献】
1.皮秒时间相关单光子计数光谱仪的核心技术 [J], 张秀峰;宋克菲;于涛;韩炳冬;盛翠霞;林久令
2.时间相关单光子计数记录快速荧光寿命图像 [J], Bertram SU;Vicky KATSOULIDOU
3.时间相关单光子计数荧光寿命测量中数据获取和处理 [J], 龚达涛;刘天宽;虞孝麒
4.基于弹性变分模态提取的时间相关单光子计数信号去噪 [J], 汪书潮;苏秀琴;朱文华;陈松懋;张振扬;徐伟豪;王定杰
5.IEC/TS 62607-3-3:2020《纳米制造-关键控制特性-第3-3部分:发光纳米材料-时间相关单光子计数(TCSPC)测定半导体量子点荧光寿命》标准解读 [J], 樊阳波;王益群
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荧光寿命测定的现代方法与应用
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化学通报
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［!］ 相调制技术 相调制技术也称之为 “频域法” （ "#$%&$’()*+,-./’ 0$12,3） 。相调制与 45675 不同之处在于样 品被正弦调制的激发光激发， 发射光是激发光的受迫响应， 因此发射光和激发光有着相同的圆频率 ， 但是由于激发态的微小时间停滞— — —荧光寿命， 调制发射波在相上滞后激发波一个相角 "。 （!） 另外， 相对于激发波， 发射波被部分解调， 其振幅比激发波的振幅小。利用实验测定的相角 " 和解 调参数 ! （发射波振幅与激发波振幅之比） 可计算出相寿命 （ 和调制寿命 （ ， 对于单指数衰减， #8） #-） ［9］ 。 #8 与#- 相等。关于相调制法荧光寿命的测定原理可参见文献
（ " ）# !! "#$ （ $ " %!） !
式中! 为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数， 因此可将上式改写为：
（ （ $ " %!） & " ）# &! "#$
其中 & ! 是时间为零时的荧光强度。于是， 荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：
$) ! #（" ’ ( ’(）
也就是说荧光强度衰减到初始强度的 ) + " 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿 命。实际上用荧光强度的对数对时间作图， 直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以 理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即 这样就形成了实验测定的荧光强度 返回基态， 有的甚至可以延迟到 * 倍于荧光寿命时才返回基态， 衰减曲线。 由于实际体系的复杂性， 荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述：
荧光寿命测定方法
λ（t）＝ αI（t） 式中：α 是比例系数。说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100个 激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
dn2(t)/dt=-(dn21/dt)sp=-A21n2(t) n2(t)= n2(0)e -A21n2(t)
定义粒子数密度由t=0时的n(0)衰减到它的1/e时所用的时间为E2能级的平 均寿命τ。
τ=1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为
荧光寿命测定方法
一、荧光寿命的概念 二、测定荧光寿命的几种方法 三、时间相关单光子计数方法TCSPC 四、TCSPC技术优缺点 五、荧光寿命测定中可能存在的问题
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值
一、荧光寿命的概念
一、荧光寿命的概念 假如100个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电
• 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)；
• 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率；
• 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011
时间相关单光子计数法测量荧光寿命（一）实验目的与要求目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。
（二）实验原理1 时间相关单光子计数器工作原理TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。
1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。
TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。
另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。
这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。
几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图1 TCSPC 的工作原理简图图2 时间相关单光子计数2 荧光寿命及其含义假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。
假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dtt dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。
TCSPC荧光寿命工作原理
Techcomp LtdTCSPC 时间相关单光子计数技术基本原理说明Dr. Hailin Qiu2011-9-3qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjk lzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbn mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz xcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmrtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw TCSPC 时间相关单光子计数技术 基本原理说明 2011-9-3 Dr. Hailin Qiu荧光寿命测试—TCSPC工作原理处于分子轨道基态的电子吸收高能量光子的激发后，跃迁到激发态，产生电子-空穴对，这个过程我们称为光致激发，处在激发态的电子从第一激发单重态回到基态，以发光的形式释放出能量，整个过程称为光致发光的荧光过程。
时间相关单光子检测
时间相关单光子检测一、时间相关单光子检测是啥呢？嘿呀，咱先聊聊这个听起来就很酷炫的“时间相关单光子检测”吧。
其实呢，这就像是一个超级精密的时间侦探在追踪那些超级微小的光子。
你想啊，光子那么小，要检测它们就已经很难了，还得和时间关联起来，这就像是在一堆沙子里找特定的一粒，还得知道它啥时候出现的呢。
二、它有啥用呢？这玩意儿用处可大啦。
比如说在科研领域，就像研究一些超微观的物理现象的时候，它能帮我们看清楚那些原子、分子啥的在极短时间内的变化。
就好比你想知道一个超级小的魔术是怎么变的，这个检测就能给你把每一个瞬间都揭露出来。
在医学上呢，也能发挥作用，比如说检测一些生物分子的活动啥的，就像是给身体里那些小小的“居民”拍一个超精细的活动纪录片，而且还是带时间轴的那种哦。
三、它是怎么做到的呢？这里面的门道可不少呢。
首先得有一个能检测单光子的设备，这个设备就像是一个超级敏感的眼睛，能捕捉到那些微弱的光子信号。
然后呢，还得有一套很厉害的计时系统，这个计时系统得非常非常精确，就像那种一秒钟能分成无数小份的时钟一样。
当光子被检测到的时候，这个计时系统就能把这个时间记录下来，这样就实现了时间相关的检测啦。
不过这过程可不像我说的这么简单，中间涉及到好多高科技的原理和技术呢。
四、它的发展历程时间相关单光子检测可不是一下子就这么厉害的。
最开始的时候呢，人们可能只是有了一个模糊的想法，就像在黑暗中看到了一点小亮光。
然后经过好多科学家的努力，一点一点地改进设备、优化技术。
就像盖房子一样，一块砖一块砖地往上垒，慢慢地就建成了现在这个看起来很厉害的样子。
在这个过程中，也遇到了好多困难呢，比如说怎么提高检测的灵敏度啊，怎么让计时更精确啊，不过这些困难都被聪明的科学家们克服啦。
五、未来的展望我觉得这个时间相关单光子检测以后肯定还能更厉害。
说不定能在更多的领域发挥作用，像探索宇宙的奥秘啦，研究那些神秘的外星物质啥的。
也可能会变得更小更方便，就像手机一样，人人都能拿着它来检测身边那些微观世界的小秘密呢。
荧光寿命谱
荧光寿命谱
荧光寿命谱（Fluorescence Lifetime Spectrum）是一种用于研究物质荧光特性的光谱技术。
荧光寿命是指荧光物质在激发态下的寿命，它与物质的化学结构和所处环境密切相关。
通过测量荧光寿命，可以获取关于物质结构、性质和微观环境的信息。
荧光寿命谱测量技术主要包括时域和频域两种方法：
1. 时域荧光寿命测量：通过测量荧光信号随时间的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC）技术，可以测量寿命范围从几十皮秒到几秒的荧光过程。
2. 频域荧光寿命测量：通过测量荧光信号在激发光源频率范围内的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用相调制（Phase Modulation）和频闪（Frequency Flash）等技术，可以测量寿命范围从几十兆赫兹到几十吉赫兹的荧光过程。
荧光寿命谱在物理学、化学、生物学、材料科学等领域有广泛的应用。
例如，在生物医学研究中，通过测量荧光寿命谱可以研究生物分子之间的相互作用、蛋白质的构象变化等；在材料科学中，可以研究材料的电子结构和光学性质等。
荧光寿命测定方法.
五、荧光寿命测定中可能存在的问题
• 当荧光寿命值与仪器自身响应时间为同一量级时，实测结果为二 者的卷积，需要对结果进行解卷积，扣除系统响应时间的影响。 • 发光材料自身存在荧光俘获效应，尽量减小样品厚度。
谢谢大家！
均寿命τ 。 τ =1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为 d n ( t)/d t= - (Γ + knr ) n ( t) 其中n ( t) 表示时间t 时激发态原子的数目,由此可得到激发态物质的单指数 衰减方程。 n ( t) = n0 exp ( - t/τ) 式中τ为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改 写为: I ( t) = I0 exp ( - t/τ) 其中I0 是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: τ = (Γ + knr ) - 1 也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物质 在测定条件下的荧光寿命。
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t） 只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区间 的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、矩 法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
一、荧光寿命的概念
自发辐射跃迁的过程是一种只与原子本身的性质有关，与辐射场无关的自
发过程。A21的大小与原子处在E2能级上的平均寿命τ 2有关。 E2能级上的粒子数密度n2随时间的变化率
基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术
第２ ２卷第 ８期
２１ ０ ０年 ８月
强 激 光 与 粒 子 束
Ｈ Ｉ Ｈ ＰＯ Ｗ ＥＲ ＬＡ Ｓ Ｇ ＥＲ Ａ Ｎ Ｄ ＰＡ ＲＴ Ｉ ＣＬＥ ＢＥＡ Ｍ Ｓ
Ｖｏ． ２，ＮＯ ８ １２ ．
Ａ ｕｇ ．， ２ １ ００
文章 编 号 ： １ ０ — ３ ２ ２ １ ） ８ １ ３ — ４ ０ １４ ２ （ ０ ０ ０ —７ １０
同时 记 录 荧 光 光 子 数 ， 以 提 高计 数效 率 和信 息 量 ， 可 以在 稳 态 图像 中 分 离 不 同荧 光 团 ， 成 ４维 图像 。并 可 还 形
采 用 多 光 子 激 发技 术 ， 用 长 波 长 光源 发 出 的两 个 或 多 个 光 子 可 以 激 发 出一 个 短 波 长 的光 子 。多 个 光 子 必 须 利 几 乎 同 时 到 达激 发 点 ，才能 提供 被 激 发 分 子 足 够 的 能 量 以产 生 荧 光 。多 光 子 激 发 波 长 较 长 ， 物 组 织 对 其 散 生 射 减 小 ， 而 可 以 穿 透 到更 深 层 的组 织 ， 而提 高荧 光 成 像 深 度 和 空 间 分 辨 力 ， 减 少 对 活 体 样 品 的损 伤 。 因 从 并 关键 词 ： 荧 光 寿命 ； 时 间 相 关 单光 子 计 数 ； 多 光子 激 发 ； 多 波 长 成像
发光 强 度 衰减 过 程 时 间 的不 同 ， 获得 荧 光 团分 子 内 部 的 能级 结 构 ， 来 同时 可 用来 区分 样 品 中的 不 同分 发光强 度衰减 函数定 量 图能对荧 光分 子 团及 其周 围 的环 境产 生很高 的 区分 度 ， 故荧 光 成 像技术 在生 物组织 的功能性 成像 中特别 有效 。ｘ射线 是现 在最 常 用 的分析 检 测癌 症 和其 它 疾病 的工具 ， 是 但 ｘ射 线 的危 险性 和局 限性是众 所周知 的 ， 现在还 没有一 种 安全 技术 能 够代 替 它进 行 软组 织成 像 。荧 光 寿命成 像 由于其 完全 非侵人 性 、 无损 性 、 电离化辐射 ， 非 以及 能够 显示组 织 中各 种化 学组 分 ， 因而能提供 有用 的功能 信 息 ］ 。荧光 寿命成 像技术 是通 过样 品微环境 内荧 光寿命 的测 量 以反映微 结构 与微环 境 的不 同，因此 需将 荧光 寿命测量 和显微 测量 结合起 来 ， 具有 高 的时空 分辨力 ， 进行 生 物活 体测 量 。因此 该技 术在 生 物 物理 、 能 ４ ］ 生物 化 学及 临床 医学 诊断 等领域 具有较好 的应 用前 景 。国际上从 ２ Ｏ世纪 ８ ０年代 末才 开始荧 光寿命 成像显 微技术 方 面 的研 究工作 ， 但发 展较快 ， 已取得一 些研 究成果 。最早 从 事荧光 寿命成 像显微 技术 方面研究 的是 日本 的 并
一种实现显微荧光寿命图的测量方法
第31卷第3期Z005年5月光学技术OPT I CAL TEC~N I UEVOl.31NO.3M a y Z005文章编号!100Z-158Z Z00503-03Z6-04一种实现显微荧光寿命图的测量方法%林子扬!牛憨笨!郭宝平!屈军乐!彭文达!田劲东深圳大学光电子学研究所光电子器件与系统教育部重点实验室深圳518060摘要!将脉宽1Z0f s重复率76M~Z激光引入激光扫描显微镜的激发光路利用其扫描系统对荧光标记样品激发扫描将激发出的荧光从荧光探测光路引入备用的外部探测口在探测口接一快速光电倍增管将光电倍增管的信号送给时间相关单光子计数器获得时间相关的荧光强度图最后通过计算机处理获得荧光寿命图应用此系统对青色荧光蛋白CFP黄色荧光蛋白YFP荧光寿命进行了测量并应用CFP YFP实现荧光共振能量转移的测量通过实验看出利用已有的激光扫描显微镜配合较先进的寿命测量方法可以很好地实现显微荧光寿命图的测量关键词!荧光寿命寿命测量荧光标记寿命图中图分类号!O43Z.Z文献标识码!AM et hod achievi n g fl uorescence lifeti m e m icro＿i ma g e Ll N z i＿y an g Nl U Han＿ben GU O BaO＿p i n g OU Jun＿l e PEN G W en＿da T l AN Ji n g＿dOn g Instit ute Of O p t Oel ectr Onics ShenZhen Uni versit y Ke y LabOrat Or y Of O p t O＿electr uOnics D evices and S y ste m s ShenZhen Uni versit y M i nistr y Of Educati On ShenZhen518060Chi na Abstract Laser p ulses Of1Z0f s durati On and76M~Z re p etiti On rate Were br Ou g ht i n eXciti n g li g ht p at h Wa y Of laser scanni n g m icr OscO p e and t he sa m p le Of fl uOrescent ta g s Was eXcited usi n g t he scanni n g s y ste m Of l aser scanni n g m icr O-scO p e.The fl uOrescence eXcited b y eXciti n g li g ht Was br Ou g ht i n eXter nal detected p Ort f r O m fl uOrescence detecti On p at h-Wa y.The f ast p hOt O multi p li er Was cOnneXted On t he p Ort.The si g nal Of t he f ast p hOt O multi p li er Was sent t O ti m e＿cOrrel a-ted si n g le p hOt On cOunti n g and ti m e＿cOrrel ated fl uOrescence i ntensit y i m a g e Was g Ot.Than t he cO m p uter p r Ocesses t he i m a g e and t he fl uOrescence lif eti m e i m a g e Was Obtai ned.The fl uOrescence lif eti m e Of c y an fl uOrescent p r Otei n CFP and y ell O W fl uOrescent p r Otei n YFP W it h t he s y ste m Were m easured.The m easure m ent Of fl uOrescence resOnance ener gy transf er W it h CFP and YFP Was achi eved.W it h t he eX p eri m ents t hat t he fl uOrescence lif eti m e m icr O＿i m a g e m easure m ent can be Well dOne b y cO mbi ni n g l aser scanni n g m icr OscO p e W it h advanced m et hOd Of fl uOrescence lif eti m e m easure m ent is shO Wed.K e y words fl uOrescence lif eti m e lif eti m e m easure m ent fl uOrescent ta g s lif eti m e i m a g el引言荧光蛋白标记方法在生物医学研究领域得到越来越广泛的应用和认可例如绿色荧光蛋白GFP 青色荧光蛋白CFP黄色荧光蛋白YFP GFP 可以和各种蛋白质融合来研究活细胞中蛋白质的形貌运动和化学特性等它为理解蛋白质的功能提供了一个重要的新方法现在荧光蛋白已成为的重要的研究工具如跟踪量化单一蛋白和复合蛋白探测蛋白质＿蛋白质分子之间的相互作用作为一种传感器描述生物事件和信息有关这方面的详细情况可参考文献1在这些应用中主要是探测荧光光强和荧光强度的变化但荧光强度的变化不足以灵敏反映这些现象中的荧光变化除荧光光强的变化外另一个重要荧光特征就是荧光寿命的变化荧光蛋白所处的环境变化蛋白质构象的变化蛋白质之间相互作用的变化等都会改变荧光蛋白的荧光寿命所以荧光寿命的变化携带了许多重要信息而且比荧光强度反映灵敏另外荧光寿命不受激发光强弱的影响也不受探测器的电压大小的影响这些都有利于研究工作国外已开展了此类荧光寿命的测量和荧光寿命图的获取工作但国内这方面的工作很少这要求显微激光扫描的同时进行寿命测量这里我们尝试了一种改进激光扫描共聚焦显微镜利用时间相关单光子计数器实现荧光寿命测量并获取荧光寿命图的方法因为时间相关单光子计数技术通过近几年的发展有了较大的提高特别是在计数速率和时间响应方面Z6Z3%收稿日期!Z004-06-07收到修改稿日期!Z004-11-01E-m ail lZ y＠ 基金项目!国家自然科学基金重点项目NO.60138010作者简介!林子扬1958＿男浙江人深圳大学副教授博士从事生物光子学激光应用研究2时间相关单光子计数荧光寿命测量的基本原理时间相关单光子计数荧光寿命测量是一种时域皮秒时间分辨率的弱光信号的测量方法 时间相关单光子计数的原理是基于对周期性光信号的单光子探测的 通过对单个光子的探测时间的测量 重建出整个光信号的波形 此方法是依据这样的事实 即探测很弱的高重复频率光信号时 这种光信号是如此的弱 以至于在一个信号周期内探测到一个光子的几率远小于1 因此探测多个光子情况可忽略 原理如图1所示 探测器接受到的信号由一串随机分布的脉冲组成 每个脉冲表示探测到了光子 有许多信号周期内没有光子 其他周期是含有一个光子的脉冲 而含有几个光子的周期信号几乎是没有的 当探测到一个光子就记录下该光子对应的探测器脉冲时间 并在该时间对应的计数存储器上加1 经过多次探测后 在时间计数存储器内就记录了随时间分布的光子数柱状图 柱状图又与荧光光强度分布是相关联的 从而构建出荧光光脉冲的波形图1TCSPC 测量原理时间相关单光子计数具有超高时间分辨率 可达Z 5p s 超高灵敏度 低于单个光子水平 短的测量时间 高动态范围 高线性度 非常好的信噪比和高增益稳定性 有关时间相关单光子计数器原理的详细情况还可参阅文献 3 43方法与装置我们目的是要达到能测量细胞样品上某一点的荧光寿命和感兴趣区域的荧光寿命图 为了实现测量的目的 我们的方法思想是 将飞秒激光引入激光扫描共聚焦显微镜的激发光路 以便可以利用激光扫描共聚焦显微镜的扫描系统 对样品感兴趣区域进行荧光激发扫描 将激发出的荧光由一设置的反射镜从激光扫描共聚焦显微镜荧光获取通路中反射到备用外部荧光出口 在出口处接一高灵敏 高响应速度光电倍增管 再将光电倍增管输出的信号送入时间相关单光子计数器 最后通过软件处理获得感兴趣区域的荧光寿命图和单点的荧光寿命曲线图Z 为此方法和装置的示意图 我们利用已有的徕卡D M I RE 激光扫描共聚焦显微镜 配置相干公司的钛宝石飞秒激光器 日本滨松公司的R3808U ＿50MCP 光电倍增管和Becker &~i cklGmb ~公司的SPC ＿730时间相关单光子计数器及相应的单光子计数获取软件与寿命分析软件 通过光学系统将飞秒激光引入激光扫描共聚焦显微镜 并使其光路在显微镜内与原A r Laser 激光激发光路重合 同时 分一束光给快速光电管二极管 作为单光子计数器的计数与时间记录控制信号 将R3808U ＿50MCP 光电倍增管接在徕卡的D M I RE 激光扫描共聚焦显微镜的备用荧光出口 在显微镜内设置一光路转换开关 在分光棱镜之前 让飞秒激光激发样品的荧光能从备用荧光出口出射 另外制作了一个加载滤光片的装置 放在R3808U ＿50MCP 光电倍增管之前用作滤出感兴趣波长的荧光 把R3808U ＿50MCP 光电倍增管输出的信号接入单光子计数器作为计数信号 用一台奔腾皿＿1000M~Z 微机作控制与处理 改装后 设备即可进行激光共聚焦扫描 也可进行荧光寿命测量 操作时 激光共聚焦扫描没有任何改变 在做寿命测量时 首先将激发光转到飞秒激光 关闭其它激光 找到待测目标 然后将显微镜内设置的光路转换开关转向备用荧光出口方向 接着设置好单光子计数器的各个参数 做好这些准备后 按开始激光共聚焦扫描按钮开始扫描 再按单光子计数开始按扭 获得时间相关单光子计数强度图 最后用寿命分析软件对强度图像做寿命分析 并获得寿命图图Z 测量装置示意图R3808U ＿50MCP 光电倍增管的脉冲响应半宽度为30p s SPC ＿730时间相关单光子计数器的时间响应比R3808U ＿50MCP 光电倍增管的脉冲响应半7Z 3第3期林子扬 等 一种实现显微荧光寿命图的测量方法宽度好10倍其光子计数速率达到106s既每毫秒可计数1000个光子这些为实现寿命测量提供了可靠的保证SPC＿730时间相关单光子计数器测量的时间是R3808U＿50MCP光电倍增管探测到荧光光子开始到快速光电管二极管接收到下一激光脉冲停止在光子计数时间内对样品上激光扫描的每一点多次周而复始重复开始＿停止＿开始同时激光扫描的同步信号作为SPC＿730存储单元的控制信号从而获得一幅每一点与相应荧光寿命相关的强度图通过计算机处理得到荧光寿命图4实验与应用本文使用此系统进行了实验研究来验证系统的可行性主要进行了青色荧光蛋白(CFP>和黄色荧光蛋白(YFP>的荧光寿命测量并进行了荧光共振能量转移的测量实现了两个蛋白质相互作用的应用研究荧光共振能量转移技术是现代细胞生物研究的极重要的方法它可测量几个纳米大小的分子之间距离荧光共振能量转移技术的详细描述可参阅文献5我们构建了CFP＿~SPZ7和YFP＿p38两个质粒热休克蛋白~s p Z7是一种细胞应激反应蛋白当细胞受到热~紫外线照射或其他环境应激时它能帮助细胞进行损伤的修复~s p Z7基因来自p BL UESCRI PT＿~s p Z7p38是丝裂原激活蛋白激酶家族(MAPK>的一个重要成员p38基因来自p c DNA3＿p38经常在细胞应激时被激活也可以被许多细胞因子(如肿瘤坏死因子细胞死亡因子>所激活激活的p38一般将启动细胞的凋亡过程对于细胞凋亡来说~s p Z7和p38是一对相互制约的蛋白将构建的CFP＿~SPZ7和YFP＿p38两个质粒分别转染到小鼠成纤维细胞L9Z9内和同时转染到小鼠成纤维细胞L9Z9内进行表达制成三种样品CFP＿~SPZ7＿L9Z9~YFP＿p38＿L9Z9和CFP＿~SPZ7+YFP＿p38＿L9Z9分别用于青色荧光蛋白(CFP>~黄色荧光蛋白(YFP>的荧光寿命测量和荧光共振能量转移的测量样品的制备由中科院北京生物物理研究所沈询研究组完成青色荧光蛋白(CFP>和黄色荧光蛋白(YFP>的荧光寿命测量结果如图3~图4所示图5(a>~(b>分别图3~图4中十字叉点的寿命测量结果荧光共振能量转移的测量结果见图6测量的是CFP荧光寿命为能较准确测量我们在R3808U MCP光电倍增管之前放置了Chr O m a公司的CFP带通滤光片确保只有CFP的荧光通过当发生荧光共振能量转移时作为供体的CFP荧光寿命会明显变短6测量CFP荧光寿命是否明显变化来判断荧光共振能量转移是否发生图3青色荧光蛋白(CFP>荧光寿命图和荧光寿命分布不同颜色表示不同寿命图4黄色荧光蛋白(YFP>荧光寿命图和荧光寿命分布不同颜色表示不同寿命上述实验图像获取的时间都为50s从实验结果图3~图4得出CFP的荧光寿命约为Z.3ns YFP的荧光寿命约为Z.7ns另外从相应的荧光寿命统计分布看寿命都集中这两个值的附近这说明细胞内各处荧光蛋白的表达基本相同从图5的结果明显看出当发生荧光共振能量转移时供体CFP的荧光寿命减少近1ns约为1.Z ns～1.3ns图5中左右两幅彩图颜色变化十分明显反映了CFP 荧光寿命的明显变化在图5中给出发生荧光共振能量转移时荧光强度图比较图5上排CFP荧光强度图和发生荧光共振能量转移时荧光强度图从强度变化上较难判断是否发生荧光共振能量转移由此看出通过CFP荧光寿命的变化测量研究荧光共振能量转移比荧光强度方法更好更可靠5结论8Z3光学技术第31卷图5单点荧光寿命测量结果图6荧光共振能量转移的测量结果不同颜色表示不同寿命综上本文的方法是可行的而且有它的优点首先利用了激光扫描显微镜的扫描系统不但可以得到样品上某点的荧光寿命而且可以得到样品上感兴趣区域的寿命图同时保持了显微功能使荧光寿命图的获取可以达到细胞层次其次使激光扫描显微镜的功得到扩展更重要的是使研究手段和研究水平可以得到提高其应用可包含荧光共振能量转移的测量多荧光标记的区分钙离子寿命图自体荧光寿命测量等等这些对生物医学的研究会有极大的帮助感谢中科院北京生物物理研究所沈询郑春雷在实验样品方面给予的大力支持参考文献!1L i pp i ncOtt＿S ch WartZ J Patt ersOn G~.D evel O p m ent and use Of fl uOrescent p r Ot ei n m ar kers i n li vi n g cells J.S ci ence Z003 30087.Z Becker W Ber g m ann A et al.P i cOsecOnd fl uOrescence lif eti m e m i cr OscO py b y TCSPC i m a g i n g C.SPI E B I OS Z001M ul-ti p hOt On M i cr OscO py i n t he B i O m edi cal S ci ences Z001.3O COnnOr D V Philli p s D.T i m e＿cOrrel at ed si n g l e p hOt On cOunti n g M.A cade m i c LOndOn1984.4Becker&~i ckl Gmb~.SPC＿300t hr Ou g h SPC＿730O p erati n g m anual EB OL.WWW.becker＿hi ckl.de.5FOrst er T.Z W i schen mOl ecul are Ener g i e Wander un g und F l uOres-cenZ J.Ann.5Ph y s.1948Z5775.6Basti aens P I~.S1uire A.F l uOrescence lif eti m e i m a g i n g m i-cr OscO py s p ati al resOl uti On Of bi Oche m i cal p r Ocesses i n t he cell J.T rends Cell B i Ol19999485Z.!上接第3Z5页"4~y unk y u er＿assi st ed che m i cal cl eani n g Of t hi n OXi de fil m s On car bOn st eel surf aces A.M i y a mOt O I.FOurt h I nt er nati Onal S y m p Osi u m On Laser Preci si On M i cr Of abri cati On C.Belli n g-ha m SPI E Z003.3843.5Pas1uet ser cl eani n g Of OXi de ir On l a y er E ffi ci enc y enhance-m ent due t O el ectr Oche m i cal i nduced absOr p ti vit y chan g e J.A py s.A199969S7Z7.6M e a ser cl eani n g Of OXi diZedir On sa m p l es The i nfl uence Of Wavel en g t h and envir On m ent J.A pp l.Ph y s.A199969S687690.7姚素薇.镍阳极氧化膜形成和破坏过程的光电化学响应J.中国腐蚀与防护学报1995153Z17Z Z Z.8Kaut ek W.E l ectr Oche m i cal reacti vit y Of l aser＿m achi ned m i cr O-caviti es On anOdi sed al u m i ni u m all O y s J.E l ectr Ochi m i ca A ct a Z003483Z493Z55.9Z3第3期林子扬等一种实现显微荧光寿命图的测量方法。
荧光寿命测定的现代方法与应用
荧光寿命测定中的数据处理
利用解卷积的办法可得到脉冲响应函数I ( t) ,进而求得描述样 品荧光衰减本质的荧光寿命(τ) 等有关参量。
4、数据分析 数据分析的目的在于,通过拟合实验所得荧光衰减曲线,建立一 种最能揭示荧光衰减本质、描述衰减过程的理论模型,从而对所研 究体系作出深刻的理解。随着时间分辨荧光技术日益发展,人们相 继提出了多种荧光衰减数据分析方法。例如: 非线性最小二乘法 、矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等。
荧光寿命的概念
态S1或S2后由第一单线激发态S1回到基态S0时所发生的。 荧光寿命是指分子在单线激发态 S1所平均停留的时间， 或者说处于激发态S1的分子数目衰减到原来的1/e所经历的 时间。 由于荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生 的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分 子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面 上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。
(b) 检测时间门与荧光衰 减关系示意图
频闪技术(Strobe Techniques)
频闪技术(Strobe Techniques)的优缺点： 新一代频闪分时光谱仪有着TCSPC 的准确性，比 相调制测定速度更快，操作也很方便，仪器价格也大 大降低。不过脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的 水平尚无法知道，在数据分析时应当有所估计。
时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon
Counting , TCSPC) TCSPC 的工作原理如图所示
电 信 号
荧光
电信号
累积电压信号
停止工作
时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon
荧光发射和荧光寿命 [lifetime] 的工作原理
![荧光发射和荧光寿命 [lifetime] 的工作原理](https://img.taocdn.com/s3/m/dc72b890b04e852458fb770bf78a6529647d35b5.png)
荧光发射和荧光寿命[lifetime] 的工作原理
荧光发射和荧光寿命是荧光分析技术中的重要概念，其工作原理如下：
1. 荧光发射：荧光是分子在吸收能量后，从基态跃迁到激发态，然后从激发态回到基态时所产生的光辐射。
在这个过程中，分子吸收光子能量，从基态（S0）跃迁到激发态（S1）。
根据Frank-Condon规则，分子在吸收特定波长的光子后，被激发到单线态的激发态电子能级
S1中的某一个振动能级上。
这个过程的时间约为10-15秒。
2. 荧光寿命：荧光寿命是指分子在激发态停留的平均时间，它表示粒子在激发态存在的平均时间。
荧光寿命与荧光物质的自身结构和所处的微环境（如极性、粘度等）有关，而与激发光强度、荧光团浓度等因素无关。
当激发停止后，分子激发出的荧光强度降到激发最大强度时的1/e所需的时间被称为荧光寿命。
3. 荧光寿命成像技术：通过时间分辨荧光寿命成像显微镜（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）对样品进行荧光寿命成像，可以对样品所在的微环境中的许多物理参数（如氧压、溶液疏水性等）及生物化学参数（如pH值、离子浓度等）进行定量测量。
此外，荧光寿命成像技术还可以同时获得分子状态和空间分布的信息。
4. 测量荧光寿命的主要技术：时间相关单光子计数法（Time-Correlated Single-Photon Counting, TCSPC）是目前测量荧光寿命的主要技术。
其工作原理是使用窄脉冲激光激发样品，然后检测样品发出的第一个荧光光子到达光信号接收器的时间。
通过将该时间成比例地转化为对应的电压脉冲，并进一步分析电压脉冲，可以获得荧光寿命的信息。
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时间相关单光子计数法测量荧光寿命
（一）实验目的与要求
目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法
2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法
要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；
2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；
3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；
4、学习利用Origin软件处理实验数据。
（二）实验原理
1 时间相关单光子计数器工作原理
TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。
1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。
TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。
另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。
这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。
几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图1 TCSPC 的工作原理简图
图2 时间相关单光子计数
2 荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。
假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dt
t dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。
荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：
τ = (Γ + k nr ) – 1
荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为:。
I ( t ) = I 0 exp ( - t /τ)
其中I 0 是时间为零时的荧光强度，τ为荧光寿命。
也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。
实际上用荧光强度的对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。
荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。
事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态，有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态，这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。
3 荧光寿命测定中的数据处理
由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述:∑-=i
i t a t I )/ex p()(τ
式中αi 为第i 项的指前因子。
衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。
当所测量的荧光寿命较短时，实验数据就和光源的脉冲宽度，光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。
为了去掉仪器响应对测量结
果的影响，需要解下面的积分方程：
)()()(k k k t I t L t N ⊗=
样品的实测荧光衰减曲线N (t k )，实际上为L (t k ) 与脉冲响应函数I (t ) 的卷积，即利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I (t )，进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ) 等有关参量。
实际工作中一般以胶体SiO2 (商品名Ludox) 为虚拟样品进行测定,仪器响应函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。
（三）仪器与样品
仪器：LifeSpec Ⅱ荧光光度计
样品：甲基橙染料溶液
（四）实验步骤与内容
1、实验仪器的准备：打开CO1，主机和F900电源；打开计算机，双击桌面上F900图标进入工作站；光度计开始初始化，并进行自检；当荧光光度计自检结束，处ready 状态时，则可以开始测量；
2、点击进入Signal Rate 设置窗口，先将Excitation Wavelength 和Emission Wavelength 处的Δλ均设置为0.01nm ，按回车键(Enter)或者点击Apply 确认；
3、打开样品室的盖子，将待测样品放置于样品架上，注意放置样品的位置，使激发光能落在样品上并且样品发出的光能进入探测器，然后盖好；
4、在Signal Rate 设置窗口内输入相应的Excitation Wavelength 和 Em1 Wavelength 值，逐渐加大Δλ，并调节Iris Setting 使Em1获得一个合适的Signal Rate （注意：在设置后需要按下回车或者Apply 按钮设置才真正生效，Em1的Signal Rate 千万不要超过106）；
5、点击λ按钮，选择Emission Scan ，进入设置窗口，在Emission Scan Parameters 内设置波长扫描范围、扫描间隔（step ）、停留时间（Dwell Time ）和扫描次数（Number of Scans ），设置完毕后点击Start 即开始测量，得到发射光谱(荧光光谱)；
6、点击τ按钮，选择Manual Lifetime ，进入设置菜单，在Excitation 栏内设置好激发波长和Light Source ，在Emission 1栏内设置好发射波长和Detector ，将Live 选择框勾上，然后开始设置下部的Lifetime Sample 1菜单，在Rates 标签内一边观察Stop Rate 一边调节Iris Setting 使Stop Rate 务必在2000以下，再在Time Range 标签内选择一个合适的Time Range 和Channels ，在Stop Condition 标签内根据样品情况选择一个合适的条件，设置好之后，点击New 开始测试。
(五) 数据处理
1. 测量完成后，点击保存将原始文件保存到“C:\users\导师\自己的文件夹”；
2. 点击“Zoom In”按钮，然后在图上选取一个需要进行拟合的范围，在Data 菜单
下选择“Exponential Fit中的Tail Fit，在弹出的窗口内输入数值进行拟合，得到衰减寿命；对于寿命很短的样品，在样品测量完成后，要做仪器的衰减(即IRF)。
3、拟合完成后，保存拟合的文件，共三种类型的文件，原始文件，ASCⅡ文件和图片文件：直接点击保存可以保存原始文件，点击File选择Export ASCII即可以保存成文本文件；选择save as，保存文件类型选择为Windows MetaFile可以保存成图片格式。
（六）关机程序
1. 关闭F900程序和计算机；
2. 关闭CO1电源，F900电源和主机电源；
3. 关闭laser电源以及其他使用过的仪器；
4. 在使用记录本上做好使用记录。
（七）思考题
1、荧光寿命测量中stop rate为何不能超过2000？
2、如何选择laser的重复频率和寿命测量的“时间窗口”？。