血脑屏障上的P-糖蛋白与药物转运功能

・综　述・

血脑屏障上的P -糖蛋白与药物转运功能

左明新　刘晓东(南京210009中国药科大学药物代谢研究中心)

摘要　目的:综述脑毛细血管内皮细胞上的P -糖蛋白药物外排功能。方法:根据对有关的资料的分析、归纳、总结得出P -糖蛋白与脑内药物转运的关系。结果:血脑屏障上的P -糖蛋白具有ATP 依赖性的药物外排泵的功能,能降低脑内药物的浓度。结论:利用多药耐药性逆转剂有可能提高脑内的药物转运或者降低药物的通透性减少中枢神经系统的不良反应。

关键词　血脑屏障;P -糖蛋白;药物转运

The P -glycoprotein at the blood -brain barrier and drugs delivery

Zuo Mingxin (Zuo MX ),Liu Xiaodong (Liu XD )(Center of Drug Metabolism and Pharmacokinetics ,China

Pharmacenutical University ,Nanjing 210009)

ABSTRACT OBJECTIVE :Specific drug efflux from the endothelial cells of capillary blood vessels of brain mediated by p -glycoprotein (P -gp )is described.METHODS :The conclusion that the relationship between p -glycoptein and drug delivery was drawn from datum analysis induce and summary.RESU L TS :P -glycoprotein at the blood -brain was found to function as ATP -depended efflux pump transporting various drugs out of cells and decreasing the apparent permeability of brain.CO NCL USIO N :The utilization of multidrug resistance reverses may make it possible to inhance delivery of drugs into the brain or decrease the apparent permeability in order to prevent undesirable side effects in the central neural system.KEY WO R DS blood brain barrier ,P -glycoprotein ,drug delivery

血脑屏障在物质进入脑内的过程中起着重要作用,脑毛细血管内皮细胞在结构上与外周毛细血管内皮细胞不同,脑毛细血管内皮细胞连接紧密,缺乏孔道,因此,长期以来认为物质能否通过血脑屏障主要取决于物质分子的大小和物质的脂溶性,一般认为分子量小,脂溶性大的物质容易通过血脑屏障进入脑内。但是近年来却发现一些脂溶性大的物质如环孢菌素、长春新碱、尼莫地平等在脑内的浓度非常低,特别是尼莫地平在脑组织内的浓度只有血液中浓度的1/10～1/

20[1]。相反一些水溶性的营养物质却很容易通过血脑

屏障进入脑内,这些矛盾的结果说明了物质的脂溶性的大小不全是物质能否通过血脑屏障的决定性的因素,在脑毛细血管内皮细胞膜上可能存着多种物质转运机制[2]。脑毛细血管内皮细胞膜不单是一个机械性的膜屏障,可能是一个活动的具有选择性的膜屏障,物质除了通过被动的方式进入脑内,还可以通过其他方式如受体介导的物质转运、载体介导的物质转运等进入脑内,这些转运方式多有利于脑对物质的摄取,此外

在脑内还存在物质外排系统如丙磺舒敏感的阴离子外排系统,特别是近年来发现的存在于脑毛细血管内皮细胞膜上的P -糖蛋白(P -glycoprotein ,P -gp ),其结构与肿瘤细胞上的P -gp 类似,具有ATP 依赖性的药物外排泵的功能。

P -糖蛋白首先是J uliano 和Ling 等人在研究肿瘤

细胞多药耐药性时发现的,它是与多药耐药性

(multidrug resistance ,MDR )密切相关的糖蛋白,分子量

为170K D ,是MDR 基因表达的产物,具有ATP 依赖性的药物外排泵的功能,能使细胞内的药物泵出细胞膜外使细胞内的药物浓度降低。MDR 基因属于一个小的基因家族,人类的MDR 基因有两个基因亚型(MDR 1

MDR 2),而啮齿类动物有三种基因亚型(MDR 1MDR 2MDR 3[3]。William [4]报道MDR 1基因表达的P -gp 主要与多药耐药性有关,MDR 2基因表达的P -gp 可左明新,男,26岁。1994年毕业于安徽中医学院药学系,现为中国药科大学96级药理学硕士研究生。

能主要与物质转运有关。据研究[5],P-糖蛋白的不同磷酸化作用具有改变MDR表型的作用。K arter[6]等人制备了具有特异性的P-糖蛋白单克隆抗体C219,为P -gp的研究提供了重要的研究工具。北美及荷兰的学者[7,8]采用cDNA mdr组的克隆方法确定了P-gp的氨基酸序列编码,通过对人、中华地鼠及小鼠mdr基因编码的蛋白质的核酸序列分析研究,对P-糖蛋白的结构和功能有了较明确的认识,P-gp是由1280个氨基酸组成的,由12个二肽链组成的跨膜通道,分为两个同源部分,药物通过被动方式进入细胞后,一些药物与P -gp呈可逆性的结合,ATP与P-gp的核苷酸位点结合后,P-糖蛋白的磷酸基具有较强的代谢活性,能不断地反复快速进行着磷酸化和去磷酸化过程释放能量,将药物泵出细胞膜外。但是如果两个核苷酸结合位点中的任何一个失活将使P-gp功能丧失[9]。研究表明不同来源的P-gp的cDNA序列是完全相同的,并且与细胞膜主动转运系统的相关的蛋白质具有高度的同源性[10,11],例如HpB与P-gp最类似,它是一种E 型结肠溶血菌的膜蛋白,它能将α-溶血菌主动转运到细胞外。

近年来研究表明P-gp不仅存在于多药耐药性肿瘤细胞上,在机体其他正常组织中也有表达,T ohrn等人[12]证明了在脑毛细血管内皮细胞膜上也存在P-gp 的表达其功能与肿瘤细胞上的P-gp类似。在正常组织中P-gp的分布具有组织特异性,用免疫组织化学染色发现P-gp的分布在一些组织的腔面上[13],其管腔面分布提示P-gp可能参与这些组织分泌和排泄功能[14]。同样在脑毛细血管内皮细胞膜上P-gp也呈不对称的极性分布,免疫组织化学分析表明P-gp主要分布在脑毛细血管膜的腔面上[15],且发现脑毛细血管内皮细胞膜上主要是MDR2的表达,而没有MDR1的表达,这说明脑毛细血管内皮细胞膜上的P-gp主要与物质转运有关。脑毛细血管内皮细胞上的P-gp主要特征是:一是P-gp对底物作用的特异性低,易与多种底物结合。二是P-gp的外排功能是ATP依赖性的,三是两种底物可以与P-gp竞争性的结合。因此,当有两个亲合力不同的底物同时存在时,亲和力大的底物易与P-gp结合后被泵出细胞膜外,亲和力小的底物与P-gp结合的少,在细胞内容易蓄积。P-gp的底物称作MDR逆转剂。目前发现MDR逆转剂多为生物碱或天然产物如环孢菌素、利血平、长春新碱、阿霉素等,钙离子拮抗剂和钙调蛋白如维拉帕米、尼莫地平、硝苯地平等,还有内源性的甾体类物质如孕酮、睾酮等。

利用MDR逆转剂可以改变脑内药物的浓度。Akria Tsujia等人[16]用牛脑微血管内皮细胞培养液在37℃pH为7.4时,长春新碱(Vincristine VCR)在牛脑微血管内皮细胞上的累积呈时间依赖性的摄取,在60min达到稳态。当有MDR逆转剂维拉帕米时,牛脑微血管内皮细胞对VCR的摄取显著增加,而且当维拉帕米的浓度从5μm到50μm时,牛脑微血管内皮细胞对VCR的吸收呈剂量依赖性的增加,如果加入其他MDR 逆转剂如奎尼丁、氯丙嗪、甾体激素时,也能使牛脑微血管内皮细胞对VCR摄取增加。利用微透析探针将浓度为1.5μm的奎尼丁以2.5μl/min的速度直接注入脑内,当脑内的奎尼丁到达稳态浓度80μmol/L时,可使环孢菌素A在脑组织内的浓度增加2.5倍。为了进一步证明P-gp参与牛脑微血管内皮细胞的物质转运功能,用10ng/ml的P-gp的特异性的单克隆抗体MRK16与牛脑微血管内皮细胞共同培育30min,结果VCR的摄取显著增加。更令人信服的证据是Alfred H等人[17]采用缺乏MDR基因的大鼠来研究地高辛在脑内的吸收和分布的影响,给大鼠静脉注射环孢菌素A,剂量为1mg/kg,静脉注射8h和24h后,结果地高辛在脑内的浓度分别是正常大鼠脑内浓度的26.3和55.2倍。

脑毛细血管内皮细胞上的P-gp是ATP依赖性的,降低脑内ATP的含量能够改变脑内皮细胞膜上的P-gp的外排功能。AK ria Tsjia等人在牛脑微细血管内皮细胞培养液中加入代谢抑制剂后,脑微细血管内皮细胞对VCR的摄取增加。当培养液中的D-葡萄糖被3-甲氧基葡萄糖取代时,VCR的吸收进一步增加。Atsushi等人[18]采用四动脉结扎的方法造成大鼠短暂性的前脑缺血模型,使大鼠脑内的ATP含量降低,结果与对照组比较环孢菌素A在脑内的通透性增加了2.7倍。可能是因为脑内的ATP含量降低,脑内皮细胞膜上的P-gp药物外排功能减弱使药物在脑内蓄积增加有关。

根据P-gp的生理特性,利用MDR逆转剂与P-gp的亲活力的不同,可以改变药物通过血脑屏障的转运。环孢菌素A(cyclosporin A,CsA)的亲活力比长春新碱(Vincristine VCR)的亲活力大,两药合用后,CsA能抑制VCR与P-gp的结合,使得更多的VCR进入脑内[19]。MDR逆转剂不仅可以增加脑内的药物浓度,而且还可以改变药物在脑内的药物动力学参数。Sanderine Destrayand[20]用大鼠研究了P-gp抑制剂SDZ PSC833对秋水仙素的动力学的影响。结果发现秋水仙素在大鼠脑内的通透性增加了10倍。环孢菌素A 与依托甙合用后,依托甙的AUC增加了80%。T1/2延