一株高产淀粉酶枯草芽孢杆菌的筛选、鉴定及产酶条件的优化

第４１卷温州医学院学报第１期

因序列应用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件对目的序列进行多序列比对，然后采用ＭＥＧＡ４．ｏ软件中的邻位相算法（Ｎ－Ｊ法）和ｂｏｏｔｓｔｒａｐ１０００次，构建ＸＷ８６的１６８ｒＤＮＡ基因系统进化树，最终确定菌株的进化地位。

１．２．４菌株液体发酵条件的优化：①单因素选择实验：分别以不同氮源、碳源、表面活性剂、温度、ｐＨ、金属离子对产酶的影响进行选择。②发酵条件的优化、正交试验…ｕｓｌ：根据单因素选择实验结果，选择三因素三水平进行正交实验和多因素交互作用试验，运用统计学方法计算平均值和极差决定酶活最佳条件组合，最后确定酶活最佳条件。

１．２．５液体发酵条件优化前后酶活的比较：同时测定最佳条件下与基础培养基常规条件的菌株发酵液酶活单位。分别得出其最高酶活，重复三次，计算酶活提高率。

２结果

２．１菌株的分离和初筛方法样品经稀释后挑取不同菌落特征的克隆，共筛选出３３０个菌株。利

用平板碘染色逐日观察淀粉的降解动态５ｄ，共收集有酶活的菌株８６株。

２．２复筛和茵椿的酶活稳定性测定结果用碘．淀粉二点比色法从８６株初筛菌株中筛选出较高酶括菌株２０株。再用ＤＮＳ进行淀粉酶活性测定，回归方程为Ｙ＝Ｏ．０１３Ｘ－Ｏ．０８１，，＝ｏ．９９９１１８６，标准误为０．１６。用配对ｔ检验对两种方法进行比较，结果显示差异有统计学意义（尸＜０．０５）。最终我们确定２株酶活性较高的菌株（命名ＸＷ８２号、ＸＷ８６号）。将酶活较高的两菌株同步传代４０代并逐代进行酶活测定，结果发现ＸＷ８２号菌株续传３２代后酶活大幅下降，酶活力低于１００Ｕ／ｄＬ（ＤＮＳ法），ＸＷ８６号菌株续传４０代仍保持高酶活。

２．３茵圈比与酶活我们选择２０株有酶活的菌株测定它第３天的菌圈大小和粗酶液的酶活（ＤＮＳ法）比探讨它们的相关性。数据进行线性回归分析，结果厅产ｏ．４４１，Ｐ＝Ｏ．００ｌ。

２．４细菌种属鉴定

２．４．１传统形态和生理生化鉴定：将ＸＷ８６原始菌株在ＬＢ淀粉固体培养基上分区划线培养获取单个菌落－２４ｈ后菌落直径可达４～６ｍｍ，乳白色，不透明，边缘不整齐，迎光观察呈白蜡状。各菌落沿划线蔓延呈长线片状。革兰染色油镜观察为革兰阳性。菌体粗大，长杆状，可见椭圆形芽胞位于菌体中间和次极端，呈长链状排列。生化鉴定由ＶＩＴＥＫ系统自动分析和储存ＢＡＣ试条鉴定，生化反应结果符合Ｂａｃｉｌｌ￡，ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ２．４．２１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增和序列分析：从１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳图可看出ＰＣＲ得到的扩增产物约为１．５ｋｂ，符合１６ＳｒＤＮＡ片断大小。由上海鼎安生物技术有限公司序列测定得１６ＳｒＤＮＡ序列为１４６１ｂｐ，见图１。将序列上传到Ｇｅｎｅｂａｎｋ，申请登录号为（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＧＵ２４８５２７）。将测序得到的１６ＳｒＤＮＡ基因序列应用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件对目的序列进行多序列比对，然后采用ＭＥＧＡ４．０软件中的邻位相算法（Ｎ－Ｊ法）和ｂｏｏｔｓｔｒａｐ１０００次，构建ＸＷ８６１６ＳｒＤＮＡ基因系统进化树确定ｘＷ８６进化地位，见图２。可以看出菌株ＸＷ８６与ＢａｃｉＪｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ聚为一类，同源性达９９５以上，与ｓｔｒａｉｎＱＤ５１７的亲缘关系最近。

圈１Ｘ｜８６１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ产物电眯囝

围２ＸＷ８６西株１６８ｒＤＮＡ序列系统发育树

２．５茵株液体发酵条件的优化

２．５．１单因素选择实验：氮源中１％黄豆扮对ＸＷ８６产酶最有利，１％尿素也有一定作用；碳源２％淀粉量对产酶最好，麸皮也有较好的表现，玉米浆也有利于产酶但相对不明显；培养基初始ｐＨ６．５时

一株高产淀粉酶枯草芽孢杆菌的筛选、鉴定及产酶条件的优

化

作者：陈相达， 戴慧慧， 刘燕， 李圆圆， 翁丛丛， 茹波， 曾爱兵， CHEN Xiangda， DAI Huihui， LIU Yan， LI Yuanyuan， WENG Congcong， RU Bo， ZENG Aibing

作者单位：陈相达,戴慧慧,刘燕,李圆圆,翁丛丛,茹波,CHEN Xiangda,DAI Huihui,LIU Yan,LI

Yuanyuan,WENG Congcong,RU Bo(温州医学院,仁济学院,浙江,温州,325035)， 曾爱兵,ZENG

Aibing(温州医学院,生命科学学院,浙江,温州,325035)

刊名：

温州医学院学报

英文刊名：JOURNAL OF WENZHOU MEDICAL COLLEGE

年，卷(期)：2011,41(1)

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