蚕豆病的设计性试验
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亚铁血红蛋白
高铁血红蛋白还原酶
高铁血红蛋白
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体)
实验反应方向
? 一、实验目的
? 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性 以及发病原因
? 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的实验原理及方法
? 3、了解蚕豆病的发病机制及原因
? 二、实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚 铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）, 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作 用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程 中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝 作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖 途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。 所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下 降（分光光度技术）。
? 三、实验器材及试剂
? 器材：离心机、分光光度计、微量移液器
?
水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管
? 试剂： ① 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 ② 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、 ③ 0. 28 mol/
L 葡萄糖溶液、混合液 （等量①+②+③）、 生理盐水、抗凝剂、患者静脉血、
从生化代谢解释患儿的临床表现和 实验室检查结果
? 主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面
?
色苍白
?
2. 皮肤及巩膜黄染
?
3. 体温升高
?
4. 呼吸急促
1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白
G6PD↓ →NADPH+H +↓ →GSH↓ →红细胞的抗氧化能力 ↓ →红细胞 →溶血性贫血 →游离Hb>肾 →血红蛋白尿 / 膜破裂 （面色苍白） 吸收阈值 含铁血黄素尿
↓ 具有载 O2能力的 Hb 含量下降
↓ 机体缺 O2
↓ 呼吸急促
实验设计
高铁血红蛋白还 原法
实验思路
? 患者姐姐出现过此类状况推 测属于家族性遗传，且患者 在食用蚕豆后出现症状，故 即有可能为蚕豆病。 6-磷酸 葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁 血红蛋白的还原，故可以依 据如下反应机制设计实验。
亚硝酸钠
? 蒸馏水
? 四、实验步骤
? 1、取静脉血1. 8mL 于抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg）， 混匀
? 2、离心沉淀 1000 r/ min 15 min
? 3、调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 ， （调整后全血）
? 4、1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠、1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 、0.14 mmol/ L 亚甲基 蓝液，混匀 ，得到混合试剂1ml
GSH的主要作用：① 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化 ② 与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成H2O
2. 皮肤及巩膜黄染
3. 体温升高
机理： 红细胞破裂 ↓
血红蛋白暴露 ↓
免疫系统攻击 （单核-吞噬细胞系统）
↓ 体温升高
4. 呼吸急促
溶血性贫血
? 诱因：一天前食用蚕豆 ? 既往史：姐姐也曾出现过此症状
蚕豆病发病机制
?
食用蚕豆
?
产生大量过氧化氢，不被清除
?
红细胞膜脂质被氧化破坏
?
急性血管内溶血，产生过多胆红素
? 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样
? 6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。 NADPH+H +缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管 及“S”管吸光度
? 六、实验结果 ? 实验结果计算：
计算高铁血红蛋白还原率 公式：
MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
? 5、取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入 试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1
? 红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并 吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血 红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素 。
? 胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化 剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化 氢，氧化应激可诱导 HO-1的表达，从而 增加胆红 素的量升高来抵御氧化应激状态。
理论依据
? 溶血性黄疸 ：由于红 细胞的大量破坏，使 胆红素产生过多，超 过了肝细胞摄取结合 的能力，使得尿中尿 胆原和尿胆素含量增 多。葡糖-6-磷酸脱氢 酶缺乏 ，输血不当均 会引起病症
? 蚕豆病：葡糖-6-磷酸 脱氢酶缺乏。 患者大 多在食用蚕豆后发生 急性溶血性贫血。典 型病人常出现由于大 量红细胞破坏释放出 胆红素二导致的溶血 性黄疸 ，恶心呕吐， 尿液呈酱油样 等症状
2019年设计性实验
组员：吴怡蓉、付世锦、 杨有稳、梁燕
? 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天 入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶 心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据 家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。
? 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分， 呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促， 神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染， 体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、 脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查 未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆 红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L， 未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿 液镜下未见红细胞。
ห้องสมุดไป่ตู้
红细胞
血红蛋白 血清总胆红素 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原
患儿 1.98×1012/L
53g/L 85.5μmol/L 13.7μmol/L 71.8μmol/L (++) (+) (－) (+)
正常（儿童） 4.0×1012~ 5.3×10 12/L 120-140g/L 1.71～17.1μmol/L 0～3.42μmol/L 0～13.68μmol/L
高铁血红蛋白还原酶
高铁血红蛋白
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体)
实验反应方向
? 一、实验目的
? 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性 以及发病原因
? 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的实验原理及方法
? 3、了解蚕豆病的发病机制及原因
? 二、实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚 铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）, 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作 用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程 中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝 作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖 途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。 所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下 降（分光光度技术）。
? 三、实验器材及试剂
? 器材：离心机、分光光度计、微量移液器
?
水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管
? 试剂： ① 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 ② 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、 ③ 0. 28 mol/
L 葡萄糖溶液、混合液 （等量①+②+③）、 生理盐水、抗凝剂、患者静脉血、
从生化代谢解释患儿的临床表现和 实验室检查结果
? 主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面
?
色苍白
?
2. 皮肤及巩膜黄染
?
3. 体温升高
?
4. 呼吸急促
1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白
G6PD↓ →NADPH+H +↓ →GSH↓ →红细胞的抗氧化能力 ↓ →红细胞 →溶血性贫血 →游离Hb>肾 →血红蛋白尿 / 膜破裂 （面色苍白） 吸收阈值 含铁血黄素尿
↓ 具有载 O2能力的 Hb 含量下降
↓ 机体缺 O2
↓ 呼吸急促
实验设计
高铁血红蛋白还 原法
实验思路
? 患者姐姐出现过此类状况推 测属于家族性遗传，且患者 在食用蚕豆后出现症状，故 即有可能为蚕豆病。 6-磷酸 葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁 血红蛋白的还原，故可以依 据如下反应机制设计实验。
亚硝酸钠
? 蒸馏水
? 四、实验步骤
? 1、取静脉血1. 8mL 于抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg）， 混匀
? 2、离心沉淀 1000 r/ min 15 min
? 3、调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 ， （调整后全血）
? 4、1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠、1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 、0.14 mmol/ L 亚甲基 蓝液，混匀 ，得到混合试剂1ml
GSH的主要作用：① 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化 ② 与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成H2O
2. 皮肤及巩膜黄染
3. 体温升高
机理： 红细胞破裂 ↓
血红蛋白暴露 ↓
免疫系统攻击 （单核-吞噬细胞系统）
↓ 体温升高
4. 呼吸急促
溶血性贫血
? 诱因：一天前食用蚕豆 ? 既往史：姐姐也曾出现过此症状
蚕豆病发病机制
?
食用蚕豆
?
产生大量过氧化氢，不被清除
?
红细胞膜脂质被氧化破坏
?
急性血管内溶血，产生过多胆红素
? 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样
? 6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。 NADPH+H +缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管 及“S”管吸光度
? 六、实验结果 ? 实验结果计算：
计算高铁血红蛋白还原率 公式：
MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
? 5、取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入 试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1
? 红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并 吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血 红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素 。
? 胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化 剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化 氢，氧化应激可诱导 HO-1的表达，从而 增加胆红 素的量升高来抵御氧化应激状态。
理论依据
? 溶血性黄疸 ：由于红 细胞的大量破坏，使 胆红素产生过多，超 过了肝细胞摄取结合 的能力，使得尿中尿 胆原和尿胆素含量增 多。葡糖-6-磷酸脱氢 酶缺乏 ，输血不当均 会引起病症
? 蚕豆病：葡糖-6-磷酸 脱氢酶缺乏。 患者大 多在食用蚕豆后发生 急性溶血性贫血。典 型病人常出现由于大 量红细胞破坏释放出 胆红素二导致的溶血 性黄疸 ，恶心呕吐， 尿液呈酱油样 等症状
2019年设计性实验
组员：吴怡蓉、付世锦、 杨有稳、梁燕
? 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天 入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶 心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据 家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。
? 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分， 呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促， 神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染， 体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、 脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查 未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆 红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L， 未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿 液镜下未见红细胞。
ห้องสมุดไป่ตู้
红细胞
血红蛋白 血清总胆红素 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原
患儿 1.98×1012/L
53g/L 85.5μmol/L 13.7μmol/L 71.8μmol/L (++) (+) (－) (+)
正常（儿童） 4.0×1012~ 5.3×10 12/L 120-140g/L 1.71～17.1μmol/L 0～3.42μmol/L 0～13.68μmol/L