蚕豆病的设计性试验
G6PD缺乏症设计性实验
初步判断
1天前食用新鲜蚕豆
据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情 况——遗传性
恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色 苍白脉搏150次/分，血压 80/60mmHg，血压下降，呼吸40次 /分，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍 白，皮肤及巩膜黄染，尿蛋白（++）血的证据
正常参值：红细胞数 4.0～5.5× 10^12 /L ，血 红蛋白 110～160g/L ，而此时红细胞破裂产生全 利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢 酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术 身溶血性反应，红细胞大量破裂释放出血红蛋白， 对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基 因此患者红细胞 为1.98×1012/L，有明显下降；由 因位点。 于红细胞破裂，血浆游离血红蛋白显著增高，超过 结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能，出现酱油色 的血红蛋白尿，而血红蛋白53g/L，降低 红细胞大量破坏，在单核-吞噬细胞系统产生胆红 素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的 能力，造成血液中未结合胆红素浓度明显增高，发 生溶血性黄疸,皮肤及巩膜黄染 ，尿胆红素(－) 。肝 对胆红素的摄取、转化、排泄增多，过多胆红素进 入胆道系统，肠肝循环增多，使得尿中尿胆原和尿 胆素含量增多，故尿胆素原(+)
正常.红细胞数 4.0～5.5×10^12 /L ，血红蛋 白 120～160g/L 患者.红细胞 1.98×10^12 /L，血红蛋白53g/L 正常. 血清总胆红素1.71~17.7μmol/L 结合胆 红素1.7~6.8μmol/L，未结合胆红素 10.26±6.84μmol/L 患者. 溶血清总胆红素85.5μmol/L 结合胆红 素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，皮 肤及巩膜黄染 (溶血性黄疸）
蚕豆病等
蚕豆病在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。
G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。
该病通过性联不全显性遗传，G-6-PD基因在X染色体上，病人大多为男性，男女之比约为7∶1，在生吃蚕豆后数小时至数日（1～3天）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作2～6天后能自行恢复，但重者若不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。
可通过病史和高铁血红蛋白还原试验（还原率大于75％），特别是荧光点试验诊断。
一旦确诊，应立即停吃生蚕豆，输血，输液，碱化尿液，防止急性肾功能衰竭。
毒理红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）有遗传缺陷者在食用青鲜蚕豆或接触蚕豆花粉后皆会发生急性溶血性贫血症——蚕豆病。
致病机制尚未十分明了，但已知有遗传缺陷的敏感红细胞，遇蚕豆中某种因子，发生急性血管内溶血所致。
临床表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。
与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。
严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。
诊断 1. 有进食青蚕豆或吸入蚕豆花粉史。
2. 临床特点①潜伏期数小时至48小时。
②中毒表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。
③实验检查：高铁血红蛋白还原试验（MHb）正常人还原率>75%(比色法)，蚕豆病患者MHb还原率31%～74%（杂合子遗传者），还原率<30%（纯合子型）；血中含变性珠蛋白小体（赫恩兹小体）可高于5%以上（正常为0～0.28%）。
急救处理1. 人工催吐。
蚕豆抗病性鉴定报告单
蚕豆抗病性鉴定报告单
报告人：XXX
鉴定对象：蚕豆样本A
鉴定目的：测试蚕豆抗病性能，评估其抗病能力。
鉴定方法：
1. 采集样本A蚕豆株苗，并观察植株生长情况。
2. 鉴定样本A蚕豆株苗的叶片表面是否存在病斑。
3. 鉴定样本A蚕豆株苗是否存在病斑蔓延现象。
4. 对病斑进行病菌分离鉴定，确定病原菌种类。
鉴定结果：
1. 样本A蚕豆株苗生长状况良好，无明显病状。
2. 样本A蚕豆叶片表面无病斑或其他病征。
3. 样本A蚕豆株苗未出现病斑蔓延现象。
4. 经病原菌分离鉴定，样本A蚕豆未检测到任何病原菌。
结论：
样本A蚕豆具有较高的抗病能力，表现出良好的生长状况和无病斑的叶片，同时未检测到任何病原菌的存在。
鉴定人：XXX
日期：YYYY年MM月DD日。
蚕豆病的基因检测方法
一、检测目的基因G6PD基因定位于X染色体长臂2区8带ⅶ因子及红-绿色盲基因之间（Xq28）,长18Kb，中国人G6PD基因目前依法显得突变种类很多，但能引起题目中所诉临床症状的突变点可能是G1376Ｔ和G1388A点突变（G6PD基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。
G6PD cDNA1388、cDNA1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代）二、检测方法（一）. ARMS检测法,具体步骤如下：1. 临床实验室检查：（1）确定贫血程度［3］；（2）根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。
（3）G6PD活性测定，酶活性单位以每克Hb含多少国际单位来表示（IU/g），正常值为4～7 IU/g。
2.基因检测：DNA制备：按常规法，蛋白酶K消化，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
PCR引物设计：ARMS法试剂盒,引物序列为：上游引物1388L2：5′GACCTGACCTACGGCAACAGATAC3′下游引物1388M2：5′GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT3′1376M：5′TGAAAATACGCCAGGCCTCAA 3′1388L2和1388M2特异性扩增G6PD基因第12外显子cDNA1388（G→A）突变，扩增出361bp片段，而1388L2和1376M扩增cDNA1376（G→T）突变，扩增出345bp片段。
基因扩增：30 μl聚合酶链反应含基因组DNA 1.0 μg，10×反应缓冲液3.0 μl，dNTPs（2 mmol/L）3.0 μl，5′上游引物和3′下游引物各20 ng，内对照引物40 ng。
反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5U GD Taq酶后，进入热循环。
循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。
生化实验期末蚕豆病设计性实验报告
实验流程
G6PD荧光斑点试验
2.将上液置于37℃水浴10min ，再取一小滴滴于滤 纸上（第二斑点）→实验组 ；
3.取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀，取一滴 于滤纸上（第一斑点 ）→作为对照；
实验流程
计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1)
△A/min:每min吸光度的平均变化值 1000/6.22:为微摩尔消光系数 1020/20:总容量与溶血液的量之比；
红细胞G6PD活性测定
结果分析
G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断
红细胞G6PD活性测定
G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 )
试管
对照管
测定管
NADP液（ml）
Tris液（ml）
氯化镁液（ml）
蒸馏水（ml）
G6P液（ml）
37℃预热
溶血液（μl）
20
20
实验流程
立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温， 每分钟观察1次，记录吸光度的变化
红细胞G6PD活性测定
实验原理
实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是 利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟 在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次）， 求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内 NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。
方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等
G6PD荧光斑点试验
蚕豆病实验设计PPT课件
未来研究方向
深入研究蚕豆病的分子机制，探索更 多与疾病发病相关的基因和分子。
加强国际合作与交流，共同推进蚕豆 病的研究进展。
开展临床试验，验证实验设计的可行 性和有效性，为临床治疗提供更加可 靠的依据。
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治疗
对于蚕豆病患者，一旦出现症状，应立即停止食用蚕豆或接触氧化性药物，并 给予适当的对症治疗，如输血、使用抗氧化剂等。预防是关键，避免诱发因素 是减少蚕豆病发作的重要措施。
02 实验设计思路
实验目的
探究蚕豆病发病机制
通过实验了解蚕豆病发病过程中的分子机制和细胞反应。
寻找治疗蚕豆病的有效方法
通过实验研究，寻找可能的治疗蚕豆病的有效药物或方案。
实验步骤
01
02
03
04
步骤1
准备实验材料和设备，包括红 细胞样本、不同浓度的氧化剂
等。
步骤2
将红细胞样本分为实验组和对 照组，实验组加入不同浓度的
氧化剂，对照组不加。
步骤3
观察并记录实验组和对照组红 细胞在不同时间点的形态和数
量变化。
步骤4
对实验结果进行分析和总结， 得出结论。
03 实验材料与方法
现出明显的优势。
实验组内部的不同处理效果
02
实验组内不同处理方式之间也存在差异，某些处理方式的效果
优于其他处理方式。
对照组内部的一致性
03
对照组内部的数据较为一致，没有出现明显的波动或差异。
结果分析
实验组优势的原因分析
对实验组表现出色的原因进行分析，可能是由于实验设计的某些 特定因素或实验过程中的细节控制所致。
本研究通过实验设计，探讨了 蚕豆病发病机制及治疗策略， 为临床治疗提供了理论依据。
生化实验期末蚕豆病设计性实验报告课件
氧化应激
在蚕豆病患者体内，由于缺乏G6-PD，红细胞无法有效应对氧化 应激，导致红细胞膜损伤和溶血 。
蚕豆病的病理生理
溶血性贫血
由于红细胞膜损伤和溶血，蚕豆病患 者会出现溶血性贫血的症状，如黄疸 、贫血、肝脾肿大等。
我们采用了生化实验方法，通过测定蚕豆 病患者和健康人群的G6PD酶活性，对比分 析两组数据，得出结论。
实验结果
数据分析
实验结果表明，蚕豆病患者的G6PD酶活性 显著低于健康人群，这与预期结果一致。
我们对实验数据进行了统计分析，得出了 具有统计学意义的结论。
实验中遇到的问题及解决方案
问题1
部分实验数据出现异常值。
验结果的实用性和应用前景。
结论总结
总结实验结果，得出明确的结论， 指出实验的局限性和不足之处，提 出改进和完善的建议。
结果应用展望
探讨实验结果在实践中的应用前景 和价值，为相关领域的研究和实践 提供参考和借鉴。
05
CATALOGUE
实验总结与展望
实验总结
实验目的
实验方法
通过本次实验，我们成功地验证了蚕豆病 与G6PD酶活性之间的关系，并探讨了可能 的致病机制。
生化实验期末蚕豆 病设计性实验报告 课件
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 实验总结与展望
01
CATALOGUE
实验目的
掌握蚕豆病的发病机制
01
了解蚕豆病的基因突变机制，掌 握其与氧化应激的关系。
02
理解蚕豆病发病过程中的酶缺陷 及其对代谢的影响。
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案一、研究目的本试验的目的是通过多倍体诱导和鉴定，获得蚕豆的多倍体植株，并分析其对产量和抗逆性能的影响。
二、试验方法1.材料准备选取蚕豆品种，如“春蚕”等，作为试验材料。
选取健康、无病虫害的蚕豆种子作为试验材料。
2.多倍体诱导将种子表面用70%酒精消毒，然后用1%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后用无菌水洗净。
将种子置于层析纸上进行萌发，待种子萌发出完整的胚芽后，将其转移到含有2mg/L 2,4-D的MS培养基中进行培养。
培养基的pH值为5.8，培养温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光周期为16h 光照/8h黑暗。
3.多倍体鉴定对培养基中生长的组织进行染色体观察，以确定其倍性。
通过标准的细胞学方法，如根尖细胞准备、染色、显微镜观察等进行多倍体鉴定。
4.产量和抗逆性能测试将多倍体和野生型蚕豆植株种植在相同的环境条件下，每个处理设置3个重复。
在不同的生长期，如花期、结荚期和成熟期，对植株进行测量和观察。
测量产量指标，如单株产量、荚果长度、荚果宽度等，同时评估抗逆性能，如抗病性、抗旱性等。
三、数据分析收集产量和抗逆性能的数据，并进行统计分析。
使用SPSS等统计软件进行方差分析，比较多倍体和野生型蚕豆之间的差异。
根据数据分析的结果，评估多倍体对蚕豆产量和抗逆性能的影响。
四、预期结果预期多倍体蚕豆较野生型蚕豆在产量和抗逆性能方面有所提高。
通过多倍体诱导和鉴定试验，可以得到具有更高产量和更强抗逆性的蚕豆品种。
五、试验注意事项1.培养基的配制和无菌操作要严格遵守操作规程，以保证试验的准确性。
2.多倍体鉴定时，要充分观察染色体的形态和结构，进行准确的判定。
3.每个处理的重复应设置合适，以提高结果的可靠性。
4.在进行抗逆性能测试时，要注意环境条件的一致性，以消除环境因素对结果的影响。
六、试验的意义通过多倍体诱导和鉴定试验，可以培育出具有良好产量和抗逆性能的蚕豆品种。
这对于提高农作物产量和抗病虫害能力具有重要意义，也为蚕豆的栽培和利用提供了有效的技术支持。
临床蚕豆病发病机理、临床表现、实验检查及泡状细胞与海因茨小体形成机制
临床蚕豆病发病机理、临床表现、实验检查及泡状细胞与海因茨小体形成机制蚕豆病是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的一个类型，表现为进食蚕豆后引起溶血性贫血及相关症状。
蚕豆病在我国西南、华南、华东和华北各地均有发现，而以广东、四川、广西、湖南、江西为最多，在北方极为少见。
3岁以下患者占70％，男性占90％。
成人患者比较少见。
发病机理葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症是参与红细胞磷酸戊糖旁路代谢的G-6-PD活性降低和（或）酶性质改变导致的以溶血为主要表现的一种遗传性疾病。
转录G6PD的结构基因位于X染色体长臂2区8带上（Xq28)，疾病为X连锁不完全显性遗传，男性G6PD缺乏半合子和女性缺乏全合子有显性表现，男性多于女性。
G6PD参与磷酸戊糖旁路代谢途径是红细胞产生NADPH的唯一来源，可将氧化型的谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽。
G6PD缺乏导致红细胞不能产生足够的NADPH，GSH显著减少，使红细胞对氧化的攻击敏感性增高，Hb的硫基遭受氧化损伤形成高铁血红蛋白和变性Hb,沉积在红细胞膜形成海因茨小体（Heinz body），使红细胞变形性明显下降，易被单核-巨噬细胞破坏发生血管外溶血，而细胞膜脂质的过氧化作用则是血管内溶血急性发作的主要因素。
疾病只发生于氧化应激情况下，共同表现为溶血，但是轻重不一，G6PD缺乏根据溶血诱因可分：慢性溶血性贫血、新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血。
其中以蚕豆病（favism)多见。
临床表现蚕豆病（favism）多见于10岁以下儿童，男性多于女性。
起病急，一般食用新鲜蚕豆或其制品后两个小时至几天（一般为1-2天，最长15天）突然发生急性血管内溶血。
溶血程度与食蚕豆的量无关，多数病人停止食用可自行恢复，严重病例需要输血及肾上腺激素，并采取措施避免急性肾衰竭。
疾病贫血程度和症状大多很严重。
症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。
巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。
蚕豆病实验设计
NADPH影响：
1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆 固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸 2： NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化 作用 3： NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用 4：维持GSH的正常水平 GSH可以保护体内蛋白质或 酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态
磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘 油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸 可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以 合成甘油三酯则消耗原有储备的甘油三酯，使得机体消瘦。同 时体内的一些生物活性物质功能发生障碍，如胆固醇不能直接 氧化但能转化为胆汁酸、类固醇激素 、维生素D3，参与物质 代谢调节，胆汁酸具有促进脂类消化和吸收的作用；维生素D3 主要参与体内血钙和血磷的调节。生物转化作用可以对体内大 部分非营养物质进行代谢转化，或使有毒物质的毒性减低或消 除，增强这些非营养物质的水溶性和极性，从而易于从胆汁或 尿液中排除。 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白 质或酶处于活性状态，蛋白质一方面可以作为营养物质提供能 量一方面又发挥着其它重要的生物功能，而酶使得生物体内的 化学反应有条不紊的进行。
案例
患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前 食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样 色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类 似情况。
体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分， 血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白， 皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常， 肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异 常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白 53g/L，血清总胆红素85.5µ mol/L，结合胆红素 13.7µ mol/L，未结合胆红素71.8µ mol/L，尿蛋白 （++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液 镜下未见红细胞。
分子生物学实验设计 蚕豆病 G6PD 临床诊断 医学生 生化代谢 实验室检查结果 遗传病 本科生
2. 标本采集:肝素化毛细血管从手指采集外围血液
3. 取小试管3支，标明患者、正常对照和阳性对照。往各管加入混合试剂 0.2ml
4. 在反应0分钟（混匀后立即吸出）、5分钟、10分钟后，分别从各吸管吸出 反应液1滴，加在滤纸上，使充分干燥 5. 在暗室内，用波长340~370nm的紫外线照射滤纸上的斑点，检查有无荧光 6. 正常人0分钟斑点无荧光，5分钟和10分钟斑点出现荧光，而10分钟斑点荧 光最强。G6PD缺乏的患者在0、5、10分钟均无荧光
【 G6PD缺陷筛查】
【实验名称】葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的荧光斑点试验 G6PD
【实验原理】 6-磷酸葡萄糖
6-磷酸葡萄糖酸
NADP 还原
NADPH 长波紫外光365nm的 激发
荧
光
【实验方法】 基于NADPH可发出荧光，6-磷酸葡萄糖和NADP加入到测试细胞 的 溶血产物中，经短暂孵育后，混合物在滤纸上出现斑点，在长波紫光下检 测，荧光表明NADP的存在。
3.42~11.96μmol/L ↑
尿胆素原
（+）
少量
↑
胆红素形成↑
尿胆素原↑
1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查， 初步判断患儿是何种疾病？
初步诊断：蚕豆病，伴溶血性黄疸
发病原因：
遗传因素；由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低， 红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性 贫血。
2.请设计实验进一步明确诊断。
【实验器材】
恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心 机
【主要试剂】
0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）、 2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP﹢）、 6mmol/L葡萄糖-6-磷酸二钠（G6P-Na2）、溶血剂、 血红蛋白氧化试剂、0.9NaCl，ACD抗凝剂。
G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
4.孵育后混匀，取血0.1ml，加PH 7.4 磷酸盐缓冲 液10ml，混匀，2min后在波长635nm处测定吸光 度（设为SA） 5.空白对照，用未加亚硝酸纳葡萄糖的血液，同 样孵育后取0.1ml,加PH 7.4 磷酸盐缓冲液10ml， 2min后测定吸光度为B。然后加入亚硝酸钠葡萄 糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度为 ST，此为高铁血红蛋白对照
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
操作： 1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶 液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。
2.离心15min，取出，调整血细胞与血浆的比例为 1： 1 后混匀。
3.取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚 甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接 触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。
蚕豆病发病机理：
1. 蚕豆病的遗传机理 2. 蚕豆病的诱发机制 蚕豆症是一种性染色体隐性遗传,意思是女 蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病，与体内红 性的一对 X性染色体都带有疾病基因才会发 细胞缺乏葡萄糖－ 6 －磷酸脱氢酶（ G－6－PD） 病，男性只有一个 X 性染色体，所以只要这 有关。在正常情况下，人体红细胞有一种具抗氧 个X染色体异常就会发病。只有一个异常X染 化作用的物质——谷胱甘肽。 G－6－PD缺乏者， 色体的女性没有症状，但是她们所生的男孩 谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少，致使 如果得到这个异常的X染色体，就会发病。 红细胞对氧化作用十分敏感。 食入新鲜蚕豆后，蚕豆中所含的巢菜碱甙物质， 可使血液中的氧化性物质增多，导致红细胞被破 坏，从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶 血性反应。
分 子 生 物 学 设 计 性 实 验
蚕豆病的检查
蚕豆病的检查蚕豆病是由于蚕豆作物受到病原微生物的感染而引起的一种病害。
该病害常见于亚热带和温带地区的蚕豆田，并对蚕豆的生长和产量产生不利影响。
因此，及早发现和诊断蚕豆病对于及时采取防治措施以保护蚕豆产量至关重要。
本文将介绍蚕豆病的检查方法及相关技术。
一、外观检查法外观检查法是最常用的检查蚕豆病的方法之一。
在蚕豆植株生长旺盛时，可以观察到叶片和茎的异常症状。
感染蚕豆病的叶子会出现黄化、斑点、水浸和病斑扩大等症状。
受严重病害感染的茎会发生变形、褪色和溃疡。
通过观察植株的病害症状，可以初步判断蚕豆是否感染了病害。
二、病原菌分离鉴定法蚕豆病的病原菌种类繁多，包括真菌、细菌和病毒等。
要准确判断蚕豆病的病原菌种类，需要进行病原菌的分离和鉴定。
分离病原菌的方法主要有体外分生孢子法和混菌法。
体外分生孢子法是将植株叶片上的病斑切下，放入含有适当营养物质的培养基中培养，待分生孢子生长出来后，通过形态和生理特性来鉴定病原菌。
混菌法是将病斑植株与一般培养的细菌混合培养，观察细菌的生长情况从而初步鉴定病原菌。
三、病害发生率调查法病害发生率调查法是通过对蚕豆田进行随机抽样调查，来了解蚕豆病的发生情况和严重程度。
在蚕豆病流行的地区，可以选择若干个不同病害程度的蚕豆植株，统计病害发生率和病斑大小，计算病害流行的程度，并确定病害防治措施的实施时间和方法。
四、分子生物学检测法随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的分子生物学检测方法被应用于蚕豆病的检测中。
这些方法包括PCR扩增、DNA杂交和Western Blot等。
PCR扩增是一种特异性高、敏感性强的检测方法，可以检测到极少量的病原菌DNA。
DNA杂交是通过核酸探针与病原菌基因特异性结合来检测病原菌的存在。
Western Blot则是通过将目标蛋白质转移至膜上，再使用特异性抗体与之结合来检测病原菌的蛋白质。
综上所述，蚕豆病的检查方法主要有外观检查法、病原菌分离鉴定法、病害发生率调查法和分子生物学检测法。
关于蚕豆病的临床研究概述
关于蚕豆病的临床研究概述广东省人民医院儿科血液肿瘤区沈亦逵蚕豆病（Favsim）由于食蚕豆引起急性溶血性黄疸及血红蛋白尿等综合症状，系一种急性溶血性贫血疾病，俗称胡豆黄。
此病多见于地中海沿岸各国。
病例最多发生在意大利撒丁岛（Sardinia）。
我国自1952年由四川报告后，各地也相继有此病报导。
到目前止，国内文献报告已超过万例。
病例发现最多的粤东兴梅地区自1952年以来已超5000例。
由此可见蚕豆病也威胁着我国人民的健康。
作者于60年代以来曾多次参加广东省对此病的调查研究工作，对1464例临床调查研究在血液及输血副刊杂志作过报道，现结合近年临床研究及有关报道，就此病的临床研究作一概述。
蚕豆病的病因与发病机制一、G6PD缺乏是蚕豆病发病的背景经多年研究证实，蚕豆病的发生内因是红细胞-6葡萄糖磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏作为蚕豆病发病的主要原因已经肯定。
本病是由于G6PD的基因突变所致。
G6PD缺乏症是人类最常见酶缺陷病，全世界约有4亿人受累。
我国G6PD缺乏者南方高于北方，以广东、广西、海南、四川和福建等省发生率最高。
广东省G6PD缺乏发生率5.68.6%，G6PD缺乏者约400万左右。
㈠G6PD基因与基因变异类型G6PD的结构基因位点在X染色体长臂2区8带上（Xq28），全长约20Kb，由13个外显子和12个内含子组成,编码515个氨基酸。
基因突变是G6PD缺乏症的分子基础，迄今,G6PD基因的突变已达140种以上；中国人的G6PD基因突变型有28种,其中最常见的是G1376T、G1388A、A95G和G392T（表1）突变频率占70%左右。
同一地区的不同民族其基因突变型相似，而分布在不同地区的同一民族其基因突变型则差异很大。
表1中国广东籍红细胞G6PD缺乏者中最常见的四种基因突变变异型点突变位置顺序（cDNA）碱基改变氨基酸置换G1376T1376（E12）G→T精→亮G1388A1388（E12）G→A精→组G392T393（E5）G→T甘→缬A95G95（E2）A→G精→组注：E＝外显子㈡G6PD缺乏遗传方式G6PD缺乏为伴性（X）不完全显性遗传。
诊断蚕豆病的标准
诊断蚕豆病的标准
蚕豆病是一种因体内缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）引起的遗传性疾病，患者在进食蚕豆或暴露于某些药物、化学物质后可能出现急性溶血反应。
以下是诊断蚕豆病的标准：
1. 家族遗传史：蚕豆病具有明显的家族遗传性。
若家族中有确诊的蚕豆病患者，个体患病风险较高。
了解家族病史对于诊断具有重要的参考价值。
2. 典型症状：患者在食用蚕豆或暴露于某些诱因后出现急性溶血症状，如发热、黄疸、贫血等。
这些症状的出现有助于初步诊断。
3. 实验室检查：通过采集患者的血液样本进行实验室检查，观察红细胞形态及计数，了解血红蛋白水平等指标。
红细胞渗透脆性试验和高铁血红蛋白还原试验等特殊试验对于确诊具有重要意义。
4. 特殊试验：红细胞G6PD活性检测是诊断蚕豆病的金标准。
通过检测红细胞中G6PD的活性，可以明确诊断或排除蚕豆病。
5. 排除其他疾病：由于蚕豆病的症状与其他溶血性贫血等疾病相似，因此需要排除其他可能的病因。
如阵发性睡眠性血红蛋白尿、免疫性溶血性贫血等。
通过对其他相关疾病的鉴别诊断，有助于准确诊断蚕豆病。
综上所述，诊断蚕豆病需要综合考虑家族遗传史、典型症状、实验室检查和特殊试验等方面的信息。
通过全面的诊断流程，可以准确诊断蚕豆病并采取相应的治疗措施，以避免急性溶血反应的发生。
蚕豆病 实验设计
临床表现
3. 生化代谢解释
实验室检查结果
患者临床表现及实验室检查结果 患 者
1 2
正常值 37 ℃ 12 （6.0-7.0）×10 （ 170-200） g/L 75次/分 12~18次/分 100~120/60~80mmHg
3
体温 38℃ 12 红细胞1.98×10 /L 血红蛋白53g/L 脉搏150次/分 呼吸40次/分 血压80/60mmHg 面色苍白、瘦小 血清总胆红素85.5µmol/L 结合胆红素13.7µmol/L（尿胆红素（-） ） 未结合胆红素71.8µmol/L
尿胆素原（+）
G-6PD ↓ 早衰老死亡
肝细胞摄取生成
+ NADPH +H↓
单核吞噬系统
GSH ↓
分解为
红细胞过
生成
（未结合的）
血红蛋白 结合胆红素
血红素Βιβλιοθήκη 胆红素分泌进入肠管
胆素原
尿胆素原
血红蛋白尿
概念: 尿内含有大量游离血红蛋白，而无（少） 红细胞的现象。 形成机理：G6PD↓ 大量血红蛋白过早衰老 死亡 血浆血红蛋白↑ 超过珠蛋白 结合及近曲小管重吸收能力 血红蛋白尿
（3.4-17.1）µmol/L
1.7-6.8μmol／L 34.2µmol/L
（皮肤和巩膜黄染）
尿胆素原（+）
4 5
尿蛋白（++） 潜血（+）
现象解释
体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压 80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及 巩膜黄染，排尿呈酱油样色。 可以说明患者因为红细胞膜氧化破裂而发生急性溶血，导 致： 溶血性贫血，颜面惨白、气促、恶心、呕吐； 组织的坏死和细胞的破坏，引起炎症反应，引起发热； 大量的血红蛋白就会随着体液排到尿液中 ，所以尿呈酱油 样色； 急性溶血12小时后可出现溶血性黄疸。即红细胞遭到大量 破坏后释放出大量的血红蛋白,致使血浆中胆红素含量增多, 超过肝细胞的处理能力则出现黄疸。
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红细胞
血红蛋白 血清总胆红素 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原
患儿 1.98×1012/L
53g/L 85.5μmol/L 13.7μmol/L 71.8μmol/L (++) (+) (－) (+)
正常（儿童） 4.0×1012~ 5.3×10 12/L 120-140g/L 1.71～17.1μmol/L 0～3.42μmol/L 0～13.68μmol/L
从生化代谢解释患儿的临床表现和 实验室检查结果
? 主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面
?
色苍白
?
2. 皮肤及巩膜黄染
?
3. 体温升高
?
4. 呼吸急促
1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白
G6PD↓ →NADPH+H +↓ →GSH↓ →红细胞的抗氧化能力 ↓ →红细胞 →溶血性贫血 →游离Hb>肾 →血红蛋白尿 / 膜破裂 （面色苍白） 吸收阈值 含铁血黄素尿
? 诱因：一天前食用蚕豆 ? 既往史：姐Leabharlann 也曾出现过此症状蚕豆病发病机制
?
食用蚕豆
?
产生大量过氧化氢，不被清除
?
红细胞膜脂质被氧化破坏
?
急性血管内溶血，产生过多胆红素
? 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样
? 6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。 NADPH+H +缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。
? 红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并 吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血 红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素 。
? 胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化 剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化 氢，氧化应激可诱导 HO-1的表达，从而 增加胆红 素的量升高来抵御氧化应激状态。
2019年设计性实验
组员：吴怡蓉、付世锦、 杨有稳、梁燕
? 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天 入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶 心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据 家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。
? 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分， 呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促， 神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染， 体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、 脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查 未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆 红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L， 未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿 液镜下未见红细胞。
亚铁血红蛋白
高铁血红蛋白还原酶
高铁血红蛋白
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体)
实验反应方向
? 一、实验目的
? 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性 以及发病原因
? 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的实验原理及方法
? 3、了解蚕豆病的发病机制及原因
? 二、实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚 铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）, 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作 用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程 中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝 作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖 途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。 所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下 降（分光光度技术）。
? 蒸馏水
? 四、实验步骤
? 1、取静脉血1. 8mL 于抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg）， 混匀
? 2、离心沉淀 1000 r/ min 15 min
? 3、调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 ， （调整后全血）
? 4、1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠、1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 、0.14 mmol/ L 亚甲基 蓝液，混匀 ，得到混合试剂1ml
? 三、实验器材及试剂
? 器材：离心机、分光光度计、微量移液器
?
水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管
? 试剂： ① 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 ② 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、 ③ 0. 28 mol/
L 葡萄糖溶液、混合液 （等量①+②+③）、 生理盐水、抗凝剂、患者静脉血、
↓ 具有载 O2能力的 Hb 含量下降
↓ 机体缺 O2
↓ 呼吸急促
实验设计
高铁血红蛋白还 原法
实验思路
? 患者姐姐出现过此类状况推 测属于家族性遗传，且患者 在食用蚕豆后出现症状，故 即有可能为蚕豆病。 6-磷酸 葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁 血红蛋白的还原，故可以依 据如下反应机制设计实验。
亚硝酸钠
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管 及“S”管吸光度
? 六、实验结果 ? 实验结果计算：
计算高铁血红蛋白还原率 公式：
MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
GSH的主要作用：① 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化 ② 与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成H2O
2. 皮肤及巩膜黄染
3. 体温升高
机理： 红细胞破裂 ↓
血红蛋白暴露 ↓
免疫系统攻击 （单核-吞噬细胞系统）
↓ 体温升高
4. 呼吸急促
溶血性贫血
理论依据
? 溶血性黄疸 ：由于红 细胞的大量破坏，使 胆红素产生过多，超 过了肝细胞摄取结合 的能力，使得尿中尿 胆原和尿胆素含量增 多。葡糖-6-磷酸脱氢 酶缺乏 ，输血不当均 会引起病症
? 蚕豆病：葡糖-6-磷酸 脱氢酶缺乏。 患者大 多在食用蚕豆后发生 急性溶血性贫血。典 型病人常出现由于大 量红细胞破坏释放出 胆红素二导致的溶血 性黄疸 ，恶心呕吐， 尿液呈酱油样 等症状
? 5、取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入 试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1