完整word版透射电镜样品制备方法

透射电镜样品制备方法

由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求

组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

℃）下进行，以降低酶的活性，防~4℃0作最好在低温（操）4（．止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。

二．取材方法

将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。

1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）

动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的3的小块，1mm小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。

*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。

2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）

培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，

离心机4℃低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去

上清，沿壁小心加入新鲜的固定液，保持细胞成团状态，于4℃冰箱中固定2小时以上。

*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液

中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签

送至电镜室。

对于血液及其他细胞悬浮液，不宜直接固定，可在取材后将其放入离心管，以2000-4000转/分的速度离心10-15分钟，待样品在离心管底部集结成团块状后，用吸管吸出上清液，再缓缓滴入固定液稍加固定，然后用刮铲将样品取出并切割成小块，再行固定。

3.植物组织取材

植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，经适当的固定后再切成小方块。

*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。4.细菌及藻类等样品取材

对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于次，继续按3清洗PBS小时，固定结束后，2℃冰箱中固定4．

（白焕红）内描述方照文献《琼脂铸模法制备透射电镜样品》℃冰箱中固4法进行琼脂预固定。再将琼脂预包埋后的样品于定过夜。样品于该溶液稀释三倍，固定结束后，将固定液用PBS *

次，贴好标签3℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗中在4

送至电镜室。

缓冲液配方磷酸盐缓冲液（三个步骤）

）磷酸盐缓冲液（0.2M1.

0.2M的磷酸二氢钠溶液0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：甲液：

27.60g 35.61g O NaHPOH HPONa2HO 22242431.21g O) 53.65g 2H( NaHPOO) HPO(Na7H 24224271.64g 12HHPO(NaO) 2421000ml

1000ml 加蒸馏水溶解成加蒸馏水溶解成

2. 按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液

0.2M磷酸盐缓冲液的配制

pH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.6 7.8 8.0 7.4

94.7 26.5 37.5 49.0 91.5 61.0 72.0 87.0 81.0 甲液(ml)

5.3

73.5

62.5

8.5

51.0

39.0

13.0

28.0

19.0

乙液(ml)

的缓冲液。0.1M稀释，则配得1：1将溶液用蒸馏水3.