分子发光分析法
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分子发光分析法1
随的发光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配 对的 S=0 ，2S+1=1, 处于单重态，用S0表示。 • 磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。 电子在跃迁过程中伴随着自选方向的改变 S=1 2S+1=3，三重 态，用T表示。
荧光分析法特点
• 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 • 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系。
五、定性分析
➢依据不同结构的物质所发射的荧光波长不 同可鉴别物质。
➢常用比较法 ➢激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高
定性结果的可信度
第三节 荧光分析仪器
➢19世纪前 肉眼观察 ➢1928年 Jette，West发明光电比色计 ➢1939年 应用光电倍增管（PMT） ➢1952年 商品化校正光谱仪器 ➢1980年后 计算机化
迁，如S2-S1；T2-T1。
• 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭”。
系间跨越
➢发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。
➢但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有 更大的发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
荧光分析法特点
• 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 • 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系。
五、定性分析
➢依据不同结构的物质所发射的荧光波长不 同可鉴别物质。
➢常用比较法 ➢激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高
定性结果的可信度
第三节 荧光分析仪器
➢19世纪前 肉眼观察 ➢1928年 Jette，West发明光电比色计 ➢1939年 应用光电倍增管（PMT） ➢1952年 商品化校正光谱仪器 ➢1980年后 计算机化
迁，如S2-S1；T2-T1。
• 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭”。
系间跨越
➢发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。
➢但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有 更大的发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
三章分子发光分析法
If = fIa= f ( Io-I )
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
第六章分子发光分析法
ph（CH=CH）3ph 0.68 ph（CH=CH）2ph 0.28
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法和分子吸收分光光度法（MMS）是物理化学中测定物质含量和生物物质含
量的两种常用方法。
它们之间有共同点和不同之处，本文主要就这二者的原理和方法进行
介绍。
分子发光分析法（MALS）是用物质中的激发态分子把紫外线能量转换为可见光，用以表征
物质的测定方法。
该方法工作原理为紫外线照射激发态分子，激发态分子把紫外线能量转
变为可见光，然后通过光电器件检测发出的可见光，最终得出物质的测定结果。
MALS技术的优点在于检测结果准确，具有快速性，还可以检测生物样本中物质含量。
而分子吸收分光光度（MMS）是通过测量物质吸收入射光的程度，来表征物质的检测方法。
这种技术工作原理是将光源照射在样本上，样本中的物质会吸收一部分入射的紫外线，而
剩下的光经过反射和透射而到达检测器，最终通过计算获得物质的测定数值。
比较MMS和MALS，MMS技术具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，而且不受多种物质的干扰，也可以检测生物样本中的物质含量。
总之，MALS和MMS都是通过激发态分子转换紫外线能量为可见光，然后通过光电器件检测可见光，来判断物质的含量的两种常用技术，它们的优点和特点主要是MALS检测结果准确，具有快速性，而MMS则具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，也可以检测
生物样本中的物质含量。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
分子发光分析
荧光强度和荧光光谱不同
26
27
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象 碰撞猝灭荧激光发分单子重以态无的辐荧射光跃分迁子的与方猝式灭回剂到分基子态相碰撞
静态猝灭 荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光
的络合物
类型 转入三重态的猝灭 溶解氧与荧光物质 发生电子转移反应的猝灭 猝灭剂与荧光物质
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型
实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
1．如何获得较强的磷光
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级
→基态， T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
分子发光分析法与分子
分子发光分析法与分子
分子发光分析法是一种分子生物学分析技术，该技术利用激发和荧光等光学原理，可准确、灵敏地检测某一特定识别序列的DNA或RNA，根据检测结果用于病原
体的鉴定、对感染过程的追踪及毒素的检测等方面的实验。
首先，分子发光分析是一种特殊的酶联免疫吸附实验，通过向样品中添加放射
性标记的双链DNA探针，由特定酶解离双链，探针与核酸结合，可以检测出特定序列的DNA或RNA。
使用这一技术，可以追踪影响基因表达和变异的基因或基因产物。
其次，分子发光分析法还可以用于检测DNA片段和品种变异，从而便于理解特
定基因之间的关系，以及定义物种在进化过程中的节点。
通过研究其他物种的变化，可以让科学家更好地了解人类的进化和免疫过程。
综上所述，分子发光分析法在病原体鉴定、追踪感染过程、毒素检测和基因变
异检测等科学研究中发挥着重要作用。
同时，由于分子发光分析法检测精准、信息丰富，已经成为全球多学科研究的重要手段之一。
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
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2)内转换( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振
动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可 在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2S1；T2-T1。
3)荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能层中的电子跃 迁至
基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：
第五章 分子发光分析法
(Molecular Luminescence Analysis)
要求
• 分子荧光是如何产生的？ • 具有哪种结构的分子可能具有较强的荧光？ • 荧光光谱仪与紫外-可见光谱仪有何不同？
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学 和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
干扰测量的因素较多。目前在生命科学中的应用使该方 法越来越重要。
二、基本原理
(一) 分子荧光的产生
单重态与三重态
单重态与三重态
Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相 反的自旋方向，即自旋配对。
单重态: 如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的， 大多数有机物分子的基态是处于单重态的。
3)激发光谱与发射光谱的关系 a 波长比较
与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产 生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致)
b 形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。不管激发波长如何，
电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的 各个振动能层。
c 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
去活化过程返回至基态。这些过程包括：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子
因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。
激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋 方向的变化，这时分子处于激发的单重态. 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s
三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变， 这时分
子便具有两个自旋不配对的电子，即s=1，分子的多重度，M=3，
分子处于激发的三重态。
第一节 荧光分析法 一、概述
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之 间。比UV-Vis的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 试样消耗量小、方法简便： 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
2
1
V=0
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
T2 三重态
T1
2
1
V=0
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转
换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨越跃迁后，
经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-410s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
S1 系间跨跃T1（高振动能层）振动弛豫T1（低振动能层）磷光发射S0
e
S2
去吸驰活收豫化演示
e
S1
S0
e
00:33:51
S0
e
去内荧活部光化转演换示
S2
e
S1
e e
S0
S0
00:33:51
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e
S1
e
e
S0
e
第二电子激发态
基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长 λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内
完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一
种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振 动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发， 有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧 光的机理。
第一电子激发态 基态
三重态
荧光 磷光
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
(三)荧光激发光谱与发射光谱
任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发 射光谱。它们是荧(磷)光定性、定量分析的基础。 1)激发光谱
改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的 强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者 完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激 发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最 适宜的激发波长。
性 质：三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上。
表 示：T1、
T2…：第一激发三重态和第二激发三重态等。
洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子， 平行自旋要比成 对自
旋更稳定，因此三重态能级能级<相应的单重态能级。
基态 ： S0 激发态： S1、S2… 振动能级：V=0，1，2，3…
2)发射光谱
发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐 照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对 其波长作图可得荧光发射光谱。
由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光 发射光谱可用于鉴别荧光物质。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可 在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2S1；T2-T1。
3)荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能层中的电子跃 迁至
基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：
第五章 分子发光分析法
(Molecular Luminescence Analysis)
要求
• 分子荧光是如何产生的？ • 具有哪种结构的分子可能具有较强的荧光？ • 荧光光谱仪与紫外-可见光谱仪有何不同？
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学 和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
干扰测量的因素较多。目前在生命科学中的应用使该方 法越来越重要。
二、基本原理
(一) 分子荧光的产生
单重态与三重态
单重态与三重态
Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相 反的自旋方向，即自旋配对。
单重态: 如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的， 大多数有机物分子的基态是处于单重态的。
3)激发光谱与发射光谱的关系 a 波长比较
与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产 生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致)
b 形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。不管激发波长如何，
电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的 各个振动能层。
c 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
去活化过程返回至基态。这些过程包括：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子
因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。
激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋 方向的变化，这时分子处于激发的单重态. 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s
三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变， 这时分
子便具有两个自旋不配对的电子，即s=1，分子的多重度，M=3，
分子处于激发的三重态。
第一节 荧光分析法 一、概述
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之 间。比UV-Vis的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 试样消耗量小、方法简便： 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
2
1
V=0
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
T2 三重态
T1
2
1
V=0
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转
换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨越跃迁后，
经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-410s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
S1 系间跨跃T1（高振动能层）振动弛豫T1（低振动能层）磷光发射S0
e
S2
去吸驰活收豫化演示
e
S1
S0
e
00:33:51
S0
e
去内荧活部光化转演换示
S2
e
S1
e e
S0
S0
00:33:51
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e
S1
e
e
S0
e
第二电子激发态
基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长 λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内
完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一
种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振 动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发， 有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧 光的机理。
第一电子激发态 基态
三重态
荧光 磷光
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
(三)荧光激发光谱与发射光谱
任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发 射光谱。它们是荧(磷)光定性、定量分析的基础。 1)激发光谱
改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的 强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者 完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激 发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最 适宜的激发波长。
性 质：三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上。
表 示：T1、
T2…：第一激发三重态和第二激发三重态等。
洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子， 平行自旋要比成 对自
旋更稳定，因此三重态能级能级<相应的单重态能级。
基态 ： S0 激发态： S1、S2… 振动能级：V=0，1，2，3…
2)发射光谱
发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐 照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对 其波长作图可得荧光发射光谱。
由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光 发射光谱可用于鉴别荧光物质。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱