SNP检测原理和应用
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特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因 突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具 体位置。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同 的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小 有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变 性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降 低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时，DNA片 段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱 基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶 上形成不同的条带。
遗传育种的应用
检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指导 育种。
SNP经典检测方法
一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，如: 1 . 限制性片段长度多态性法PCR- RFLP； 2 .单链构象多态性法PCR- SSCP ； 3 . 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE)； 4 .等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASPCR)等
连锁不平衡性分析
原理：首先确定一批按一定间隔存在、覆盖整个基因组的 SNP标记，然后在特定群体中寻找这些SNP 标记与待研 究特征之间的关系，即确定与特征相关的SNP基因型，从 而确定导致生物出现特定性状的基因组区域。
Martin 等，为阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD) 的候选基因ApoE附近的SNP制图，在ApoE周围1.5Mb 的区域内为60个SNP分型，并通过家系连锁分析，在 ApoE基因两侧各40kb的区域内13个SNP中发现有7个连 锁，已有有力证据表明这7个SNP以及ApoE基因周围 16kb内另外两个SNP与AD连锁。
药物基因组学研究中的应用
SNPs 可以反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个体的药物 反应进行相关分析，从而确定基因在药物作用中的功能和 意义。这样既可以根据患者的遗传特性设计治疗方案，实 现“个性化治疗”，提高药效，降低药物的毒副作用，又 可以在临床试验阶段为特定的药物选择合适的受试者，提 高效率，减少费用。 Paulussen 等分析了CYP3A5基因的5′区，鉴定了两个连 锁的多态位点:T2369G、A245G，从而把表型与基因型 联系起来。这两个多态位点位于转录调控区，与基因的表 达和活性的提高有关。CYP3A5在个体间可有可无，但能 明显影响药物的代谢动力学，进而影响个体对药物的反应 及疾病易感性。Macphee等研究发现，不到10%的白人 有CYP3A5，而60%以上的非洲黑人有CYP3AP1 G244 等位基因，该基因型是表达CYP3A5所必需的，导致非洲 人对药物的需要量比其他人群高。
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较，以确定所研究的碱基是否变异，其检 出率可达100%。
特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( Genechips)
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
基于ABI遗传分析仪平台的SnapShot法； 基于Sequenom质谱仪平台的MassArray法
Taqman探针法
针对染色体上的不同的SNP位点别设计1对PCR引物和 TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增，该探针的5’端 和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 当溶液中有PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适 合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧 光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET， 发出荧光。
SNP的应用
1. 确定基因多态性和疾病的关系 2. 解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 3. 对未来疾病做出诊断 4. 研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开 发及临床合理用药 5. 个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医 鉴定及个体识别
基因组制图
“遗传图”、“物理图”、“序列图”和“转录图” 将SNPs 与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合起来以 期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传和基因组扫描等 方面作出进一步研究。 1998年，SNPs图谱，2227 个SNPs 定位和作图。 2001年，124万个SNPs的图谱。 目前超过500万个SNP位点，图谱未知。
特点： 使用高效液相色谱检测 SNPs具有检测效率高，便于自 动 化 的 优 点 ， 对 未 知 SNPs 的 准 确 率 可 达 95% 以 上 。 但 DHPLC 检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差， 不能检测出纯合突变。
阅微基因提供的SNP检测方法
基于荧光定量PCR平台的TaqMan探针法；
变性高效液相色谱( DHPLC)
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变 碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异 源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同 源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来， 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰 形或数目差异，依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的 碱基。
特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的 突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂，所 需设备贵重，不利于普及应用。
MALDI-TOF
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上 的化合物共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火， 延伸反应，突变部位配对的碱基与正常配对的碱基 不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基 的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
PCR-RFLP原理图
单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
疾病易感性研究中的应用
原理：SNPs被认为是一种稳定遗传的早期突变，与疾病 有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超 过非患者时，即表明该标记与疾病关联，通过比较分析两 者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知 的致病基因定位。
Horikawa 等，应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不 平衡的相关分析，在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现 了一个糖尿病易感基因———钙离子中性蛋白酶基因 (CAPN10基因)，该基因第三个内含子上的A/G多态性 (SNP43) 同2型糖尿病(2型DM) 连锁,该位点为纯合子G 的个体患2型DM 的风险增加，这是目前为止所发现的第 一个与2型DM相关的SNP，预示了SNP在DM相关基因研 究中的重要作用。
Taqman探针法
5’端为报告荧光基团 （reporter） 3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
Taqman探针法优缺点：
适合位点少、样本量大的情况，样本量较少的情况下，每 个样本的探针价格高
优点是特异性好、准确性高，操作简单（ABI公司有已知 探针库，可直接购买） 劣势：两个SNP位点之间太近（20bp）或者SNP序列附 近有特殊结构，设计不出来探针
SNP检测技术
阅微基因
内容简介
1 2 3
Leabharlann Baidu
SNP 概 念
SNP 研究应用 SNP 检测技术
SNP 检测方法选择
4
SNP 的概念
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的 改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一 条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷 酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。
SNP 的特点
遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNP 具有更高的遗传稳定性。 易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两种等位型 (allele) 。这样在检测时只需一个“+\-”或“全\无”的 方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样 对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法 易实现自动化。
SnapShot法
SNapShot方法工作原理
SNapShot方法操作流程
SnapShot法优缺点
通量高，一次反应可扩增最多10-15个位点，30分钟 可以检测96个样本，一台3730xl一天可以检测4000个以 上的样本 高通量分析的时候经常发生个别样本失败或者个别位点 丢失的情况，导致数据不完整，MassARRAY方法丢失的 数据进行补充的时候造价很高，一般不会去补，而该方法 可以以较低成本补充实验，因此，提供的数据完整性高。 适应性强 实验结果可靠，该方法是ABI公司在10多年前开发成 功的，历经了很多验证，发表了大量文章（SCI论文超过 9000篇），同时一些临床诊断的SNP（如KRAS等）检 测也采用该方法。
PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种 或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存 在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据 电泳的结果就可以判断是否SNP位点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制 内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。
SNP 的特点
在遗传学分析中, SNP 作为一类遗传标记得以广泛 应用，主要源于这几个特点:
密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp， 在整个基因组的分布达 3×106个，密度比微卫星标记更高， 可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。
富有代表性 某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋 白质结构或表达水平，因此，它们可能代表疾病遗传机理中 的某些作用因素。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理：根据 SNP位点设计特异引物，其中一条链(特异 链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同)，另一条链 (普通链)按常规方法进行设计，因此，AS-PCR技术是一 种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有 扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳 就能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型 的 SNP。
它包括单碱基的转换，颠换、 插入及缺失等形式。
SNP在基因组内的形式:
一是遍布于基因组的大量单碱基变异； 二是分布在基因编码区(coding region) ，称其 为cSNP，属功能性突变。
SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列； （2）在转录区非同义突变的频率，比其他方式突变的频率 低得多。
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的，高通量、 自 动化程度较高的检测SNPs的方法，较为常用的有: 1 . DNA测序法； 2 . DNA芯片检测； 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测； 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等
DNA测序法
MassARRAY
SnapShot法
该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，基于荧光标记 单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等 通量的SNP分型项目。 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多 态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体 系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪电泳后， 根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基 因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位 点。 对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同 的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小 有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变 性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降 低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时，DNA片 段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱 基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶 上形成不同的条带。
遗传育种的应用
检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指导 育种。
SNP经典检测方法
一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，如: 1 . 限制性片段长度多态性法PCR- RFLP； 2 .单链构象多态性法PCR- SSCP ； 3 . 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE)； 4 .等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASPCR)等
连锁不平衡性分析
原理：首先确定一批按一定间隔存在、覆盖整个基因组的 SNP标记，然后在特定群体中寻找这些SNP 标记与待研 究特征之间的关系，即确定与特征相关的SNP基因型，从 而确定导致生物出现特定性状的基因组区域。
Martin 等，为阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD) 的候选基因ApoE附近的SNP制图，在ApoE周围1.5Mb 的区域内为60个SNP分型，并通过家系连锁分析，在 ApoE基因两侧各40kb的区域内13个SNP中发现有7个连 锁，已有有力证据表明这7个SNP以及ApoE基因周围 16kb内另外两个SNP与AD连锁。
药物基因组学研究中的应用
SNPs 可以反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个体的药物 反应进行相关分析，从而确定基因在药物作用中的功能和 意义。这样既可以根据患者的遗传特性设计治疗方案，实 现“个性化治疗”，提高药效，降低药物的毒副作用，又 可以在临床试验阶段为特定的药物选择合适的受试者，提 高效率，减少费用。 Paulussen 等分析了CYP3A5基因的5′区，鉴定了两个连 锁的多态位点:T2369G、A245G，从而把表型与基因型 联系起来。这两个多态位点位于转录调控区，与基因的表 达和活性的提高有关。CYP3A5在个体间可有可无，但能 明显影响药物的代谢动力学，进而影响个体对药物的反应 及疾病易感性。Macphee等研究发现，不到10%的白人 有CYP3A5，而60%以上的非洲黑人有CYP3AP1 G244 等位基因，该基因型是表达CYP3A5所必需的，导致非洲 人对药物的需要量比其他人群高。
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较，以确定所研究的碱基是否变异，其检 出率可达100%。
特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( Genechips)
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
基于ABI遗传分析仪平台的SnapShot法； 基于Sequenom质谱仪平台的MassArray法
Taqman探针法
针对染色体上的不同的SNP位点别设计1对PCR引物和 TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增，该探针的5’端 和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 当溶液中有PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适 合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧 光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET， 发出荧光。
SNP的应用
1. 确定基因多态性和疾病的关系 2. 解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 3. 对未来疾病做出诊断 4. 研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开 发及临床合理用药 5. 个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医 鉴定及个体识别
基因组制图
“遗传图”、“物理图”、“序列图”和“转录图” 将SNPs 与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合起来以 期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传和基因组扫描等 方面作出进一步研究。 1998年，SNPs图谱，2227 个SNPs 定位和作图。 2001年，124万个SNPs的图谱。 目前超过500万个SNP位点，图谱未知。
特点： 使用高效液相色谱检测 SNPs具有检测效率高，便于自 动 化 的 优 点 ， 对 未 知 SNPs 的 准 确 率 可 达 95% 以 上 。 但 DHPLC 检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差， 不能检测出纯合突变。
阅微基因提供的SNP检测方法
基于荧光定量PCR平台的TaqMan探针法；
变性高效液相色谱( DHPLC)
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变 碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异 源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同 源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来， 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰 形或数目差异，依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的 碱基。
特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的 突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂，所 需设备贵重，不利于普及应用。
MALDI-TOF
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上 的化合物共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火， 延伸反应，突变部位配对的碱基与正常配对的碱基 不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基 的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
PCR-RFLP原理图
单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
疾病易感性研究中的应用
原理：SNPs被认为是一种稳定遗传的早期突变，与疾病 有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超 过非患者时，即表明该标记与疾病关联，通过比较分析两 者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知 的致病基因定位。
Horikawa 等，应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不 平衡的相关分析，在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现 了一个糖尿病易感基因———钙离子中性蛋白酶基因 (CAPN10基因)，该基因第三个内含子上的A/G多态性 (SNP43) 同2型糖尿病(2型DM) 连锁,该位点为纯合子G 的个体患2型DM 的风险增加，这是目前为止所发现的第 一个与2型DM相关的SNP，预示了SNP在DM相关基因研 究中的重要作用。
Taqman探针法
5’端为报告荧光基团 （reporter） 3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
Taqman探针法优缺点：
适合位点少、样本量大的情况，样本量较少的情况下，每 个样本的探针价格高
优点是特异性好、准确性高，操作简单（ABI公司有已知 探针库，可直接购买） 劣势：两个SNP位点之间太近（20bp）或者SNP序列附 近有特殊结构，设计不出来探针
SNP检测技术
阅微基因
内容简介
1 2 3
Leabharlann Baidu
SNP 概 念
SNP 研究应用 SNP 检测技术
SNP 检测方法选择
4
SNP 的概念
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的 改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一 条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷 酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。
SNP 的特点
遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNP 具有更高的遗传稳定性。 易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两种等位型 (allele) 。这样在检测时只需一个“+\-”或“全\无”的 方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样 对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法 易实现自动化。
SnapShot法
SNapShot方法工作原理
SNapShot方法操作流程
SnapShot法优缺点
通量高，一次反应可扩增最多10-15个位点，30分钟 可以检测96个样本，一台3730xl一天可以检测4000个以 上的样本 高通量分析的时候经常发生个别样本失败或者个别位点 丢失的情况，导致数据不完整，MassARRAY方法丢失的 数据进行补充的时候造价很高，一般不会去补，而该方法 可以以较低成本补充实验，因此，提供的数据完整性高。 适应性强 实验结果可靠，该方法是ABI公司在10多年前开发成 功的，历经了很多验证，发表了大量文章（SCI论文超过 9000篇），同时一些临床诊断的SNP（如KRAS等）检 测也采用该方法。
PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种 或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存 在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据 电泳的结果就可以判断是否SNP位点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制 内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。
SNP 的特点
在遗传学分析中, SNP 作为一类遗传标记得以广泛 应用，主要源于这几个特点:
密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp， 在整个基因组的分布达 3×106个，密度比微卫星标记更高， 可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。
富有代表性 某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋 白质结构或表达水平，因此，它们可能代表疾病遗传机理中 的某些作用因素。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理：根据 SNP位点设计特异引物，其中一条链(特异 链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同)，另一条链 (普通链)按常规方法进行设计，因此，AS-PCR技术是一 种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有 扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳 就能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型 的 SNP。
它包括单碱基的转换，颠换、 插入及缺失等形式。
SNP在基因组内的形式:
一是遍布于基因组的大量单碱基变异； 二是分布在基因编码区(coding region) ，称其 为cSNP，属功能性突变。
SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列； （2）在转录区非同义突变的频率，比其他方式突变的频率 低得多。
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的，高通量、 自 动化程度较高的检测SNPs的方法，较为常用的有: 1 . DNA测序法； 2 . DNA芯片检测； 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测； 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等
DNA测序法
MassARRAY
SnapShot法
该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，基于荧光标记 单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等 通量的SNP分型项目。 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多 态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体 系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪电泳后， 根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基 因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位 点。 对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。