多肽固相合成

发明

英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS

在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。

氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。

重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。

固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。

化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。固相合成法的诞生

多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。

到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。

1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)。因此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。

多肽合成仪的介绍

多肽合成仪的诞生

虽然Merrifield在发明固相多肽合成科学并取得巨大成功的同时，使用了自主研发的合成设备，但却没因此将多肽合成仪引入市场。1970年，Beckman公司开发的全自动多肽合成仪Beckman 990 Peptide Synthesizer 作为第一台投入市场的科研用多肽合成仪，被美国多所大学的实验室采用。

几乎同一时间，Vega Biotechnologies, Inc.公司开发出两款经济型多肽合成仪：Vega’s Coupler 1000与Vega’s Coupler 250 (不久又推出Vega’s Coupler 296),其将多肽合成后续的在线切割理念结合到设备中，所有反应器采用防爆玻璃材质，防止TFA的腐蚀。被当时的肽化学界称为最经济适用的多肽合成仪。

而今，Beckman与Vega’s两家公司均停止的多肽合成仪的研发与制造，而转向到更多面的化学合成、分离、检测技术设备的研制产业中。

多肽合成仪的发展

第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。

虽然随着生产工艺的改进和发展，如今第一代多肽合成仪已全部退出了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。

第二代多肽合成仪是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90为代表的，诞生在上世纪八十年代。此两款设备也是目前市场上仍在销售的最早的多肽合成仪。

PS3 的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会“抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方。由于多肽-固相载体具有较强的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反应“死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的甚至造成合成的失败。2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应。3）氮气消耗量大，运行成本增大。

ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间。